草莓杂交品种及其亲本遗传背景的ISSR分析

张运峰，武秋颖，张淑红，高凤菊，范永山，韩靖玲，刘海英

(1.唐山师范学院生命科学系，河北 唐山 063000；2.唐山市农业科学研究院，河北 唐山 063000；3.唐山市植物病原真菌与毒素重点实验室，河北 唐山 063000)

【研究意义】草莓(Fragaria×ananassaDuch.)果实味道鲜美、营养物质丰富，为世界七大水果之一[1]。20世纪初传入中国后，草莓产量和种植面积均为世界第一，有“水果皇后”的美誉[2]。栽培草莓为异源八倍体多年生草本植物，遗传背景非常复杂，遗传育种工作相比于二倍体植物更加困难。【前人研究进展】自20世纪80年代草莓育种方式由实生选种改为杂交育种以来[3]，草莓的遗传背景研究越来越重要，因为遗传背景差异越大的亲本，其杂种优势越强。但是，关于草莓遗传背景的研究报道很少。常琳琳等[4]利用系谱法分析了1953—2016年我国培育的108个草莓品种的亲本类型和来源，总结了草莓育种亲本的选配规律。但是，由于草莓品种交叉引种、自育自繁等活动频繁，缺乏系谱资料或系谱资料不全、不准确等现象非常普遍。分子标记技术以基因组DNA序列的多态性为基础，不受取材部位、发育时期和外界环境的干扰，对于遗传背景复杂、倍性高的草莓研究中具有显著优势。Sargentd等[5-7]研究表明，栽培草莓基因组的很多分子标记都呈现二倍化分离，因此，分子标记技术是解析栽培草莓复杂遗传背景的有效途径。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)是一种在微卫星基础上发展的分子标记，不具有较强的种特异性，揭示的多态性高，检测非常方便[8]，已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性的研究中[9]。【本研究切入点】以12种具有不同遗传背景的栽培草莓品种为研究对象，利用ISSR技术和多维尺度分析技术解析它们之间的亲缘关系，为草莓品种鉴定、杂交种质筛选提供技术基础。【拟解决的关键问题】建立草莓ISSR扩增的最适引物，探索基于ISSR试验数据的系统聚类分析与多维尺度分析技术相结合的综合技术体系来准确评估草莓的遗传背景和亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草莓试验材料均采自唐山市农业科学研究院草莓种植基地。12份草莓材料中1份来自美国，1份来自西班牙，4份来自日本，6份来自中国。除了章姬脱毒苗的变异株唐研香以外，其它均为省级或国家级审定品种。12份试验材料中有9份遗传背景清楚，其中5份材料(京桃香、粉红公主、妙香一号、唐研香、红颜)的亲本来源于章姬，2份材料(佐贺清香、幸香)源于丰香，1份材料(红袖添香)源于章姬和幸香杂交的F1代红颜；其余3份材料的遗传背景未知(表1)。

1.2 草莓试验材料的ISSR扩增

采取草莓植株幼嫩的叶片，利用磁珠基因组DNA微量提取试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司)提取基因组DNA，利用Takara rTaqDNA聚合酶进行ISSR扩增：基因组DNA 50 ng，10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 nmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，5 U/mL rTaqTM0.2 μL，ddH2O补充到20 μL；经95 ℃预变性后进行35个热循环(94 ℃ 40 s，45～55 ℃ 70 s，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃再延伸8 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶、3 V/cm电压进行电泳分离，利用Bio-Red凝胶成像系统采集电泳图像。利用章姬、京桃香、粉红公主、妙香一号、红颜和唐研香等6个品种从100条ISSR引物中筛选出条带清晰、多态性位点多、扩增产物稳定的ISSR引物，摸索不同ISSR引物的最适退火温度(Tm)，对全部试验材料进行ISSR扩增。

1.3 草莓试验材料的遗传背景分析

ISSR-PCR产物在0.5倍TBE电泳缓冲液中以3 V/cm电压、1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，Bio-Red凝胶成像系统采集电泳图像。根据电泳图谱记录清晰可重复的电泳条带，清晰且可重复的条带记为“1”，无法辨认且难以重复的条带记为“0”，获得“0-1”数据矩阵。利用NTSYS-pc version 2.02(Rohlf，1998)计算遗传距离和Nei& Li 遗传相似性系数，利用UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmatic Average)方法进行聚类分析；用IBM SPSS Statistics version 19.0.0软件进行多维尺度分析(Multidimensional scaling，MDS)。

表1 草莓种质信息

2 结果与分析

2.1 ISSR引物筛选及最适Tm值摸索

利用章姬、京桃香、粉红公主、妙香一号、红颜和唐研香6个品种进行最适ISSR引物筛选。结果表明，在100条ISSR引物中筛选出10条引物可获得反应稳定、条带清晰、多态性强的扩增条带(表1)。对这些引物进行最适Tm值摸索，结果表明10条ISSR引物的最适Tm值差异较大，在47～54 ℃之间(表1)。随着Tm值的增加，不同引物的扩增条带数量变化不同。例如，在45～55 ℃范围内，引物892在Tm值低于50 ℃时扩增条带数量随着温度的增加而增加，高于50 ℃时扩增条带数量逐渐减少，而引物811在Tm值为52.3 ℃时条带数量达到最多后，再增加温度，扩增条带数量无显著改变(图1)。

2.2 草莓试验材料的ISSR-PCR扩增

利用筛选的ISSR引物和摸索的最适Tm值对12份草莓试验材料进行ISSR-PCR扩增。结果表明，10条引物均能在12个草莓品种中扩增出清晰明亮的条带，且条带数目均在8条以上(表2，图2)。试验共获得标记条带116条，其中引物859和引物892的条带数目超过了15条。试验共获得多态性条带80条，多态性比率为68.97%。除了引物857的条带多态性比率(37.5%)较低以外，其它9个引物的多态性条带比率均超过了50%，其中引物812和引物892超过了85%(表2)。以上试验结果表明，10个引物形成的标记可以很好的区分草莓品种。

2.3 草莓试验材料间的遗传相似系数和遗传距离

12份材料间的遗传相似系数变化范围为0.5690～0.8448，遗传距离变化范围为0.1456～0.4722。红颜和白雪公主间的遗传相似系数最高(0.8448)，甜查理和圣诞红间的最低(0.5690)。章姬与其5份子代材料(京桃香、粉红公主、妙香一号、唐研香、红颜)的遗传相似系数为0.6983～0.7951，变化范围较小，说明遗传背景比较相近。均来自于丰香亲本的子代佐贺清香和幸香间的遗传相似系数为0.7414；红颜与其亲本章姬和幸香，以及子代材料红袖添香的遗传相似系数分别为0.7931、0.7759和0.7241，遗传背景非常相似(表3)。3个遗传背景未知的试验材料中，甜查理和粉红公主的遗传相似系数最高(0.7500)，这与粉红公主有美国遗传背景非常一致(表1～3)；圣诞红除了与唐研香的遗传相似系数较高(0.7155)外，与其它所有试验材料的遗传相似系数均较低，这与圣诞红来自于西班牙，而其它试验材料中均没有西班牙遗传背景相一致；白雪公主与红颜的遗传相似系数最高，推测它可能是红颜的子代或组培变异株。

1～5分别为44.2、47.5、50、52.3和54.4 ℃；M：DNA Marker-D1 to 5 are 44.2, 47.5, 50, 52.3 and 54.4 ℃；M is DNA Marker-D图1 不同Tm值条件下ISSR引物892(A)和811(B)的扩增结果Fig.1 The amplification results of ISSR primers 892 (A) and 811 (B) under different Tm values

表2 ISSR引物信息及扩增结果

1.章姬；2.京桃香；3.粉红公主；4.妙香一号；5.唐研香；6.红颜；7.红袖添香；8.佐贺清香；9.幸香；10.甜查理；11.圣诞红；12.白雪公主；M.DNA marker D1.Akihime;2.Jingtaoxiang;3.Fenhonggongzhu;4.Miaoxiangyihao;5.Tangyanxiang;6.Benihoppe;7.Hongxiutianxiang;8.Sagahonoka;9.Sachinoka;10.Sweet Charli;11.Ssanta;12.Snow White;M.DNA marker D图2 引物895(A)和851(B)的ISSR-PCR结果Fig.2 The ISSR-PCR results of primers 895(A) and 851(B)

计算遗传背景明确的各试验材料之间的平均遗传距离和平均遗传相似系数，分析各杂交品种及其亲本的遗传倾向性。结果发现：亲本之间平均遗传距离0.3258，平均遗传相似系数0.6551；亲本与子代之间遗传距离0.1950～0.3628(平均0.2607)，遗传相似系数0.7241～0.7845(平均0.7478)；亲本与

表3 12份草莓材料的遗传相似系数(右上)和遗传距离(左下)

表4 12份草莓材料的遗传倾向性分析

组培变异株之间遗传距离0.1981，遗传相似系数0.7672。可见，亲本之间、亲本与子代之间和亲本与组培变异株之间的遗传距离递减，而遗传相似系数递增，符合遗传规律。以上研究结果表明，本试验筛选出的ISSR引物能够较好地用于草莓种质材料的遗传背景分析。

2.4 草莓试验材料间的聚类分析

根据遗传相似系数建立系统发育树(图3)，利用NTSYS-pc软件对聚类树进行Cophenetic相关性检验，相关性系数为r=0.78174，说明聚类结果较好。当遗传相似系数为0.70时，12份试验材料可分为美国材料甜查理(群I)、日本和中国材料(群II)和西班牙材料圣诞红(群III)，说明中国的草莓品种的遗传背景主要来自日本品种。当遗传相似系数为0.75时，群II还可分为京桃香和佐贺清香(群II-1)，章姬、红颜、白雪公主和唐研香(群II-2)，幸香(群II-3)，及粉红公主、红袖添香和妙香一号(群II-4)等4个亚群。在群II内，群II-1和群II-4都是杂交子代，群II-2(除红颜外)和群II-3都是亲本或亲本的组培变异株。红颜与父本幸香没有归到同一亚群，而与母本章姬归到同一亚群，说明红颜在遗传背景上更接近其母本章姬，并且也具有作为其它品种杂交亲本的品质。以上研究结果说明，利用本试验筛选的ISSR引物可应用于杂交亲本的筛选。

图3 草莓试验材料的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of strawberry trial materials

2.5 多维尺度分析

基于Nei& Li 遗传距离利用SPSS软件进行多维尺度分析(图4)，stress = 0.09139，RSQ(stress and squared correlation)= 0.98504，说明多维尺度分析效果较好。从图4可以看出，12个试验材料分布于I、II和III区。I区仅有红袖添香，其杂交亲本是美国品种卡姆罗莎(Camarosa)与日本品种丰香。II区可分为两类，II-1为西班牙品种圣诞红，II-2包括章姬、唐研香、京桃香、佐贺清香、红颜和幸香共6个品种，其中中国品种唐研香、红颜和京桃香的亲本均为日本品种章姬，佐贺清香和幸香的亲本都是日本品种丰香，并且红颜是章姬和幸香的杂交F1代。III区也可分为两类，III-1为美国品种甜查理，III-2包括中国品种粉红公主、白雪公主和妙香一号，其中粉红公主和妙香一号的亲本均为日本品种章姬。还可以发现，II-2和III-2距离非常近，它们均为中国和日本的品种。以上研究结果与图3相似，从另一角度表明本试验筛选的ISSR引物对于草莓品种的遗传背景分析非常有效。

3 讨 论

在植物遗传多样性分析过程中RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)的结果精度和稳定性较差，AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)设计步骤复杂，SSR (simple sequence repeats，简单重复序列)种特异性较强，SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)则依赖高通量测序和大数据库。草莓遗传背景分析主要用于筛选具有杂种优势的亲本材料以及探索亲本与杂交后代之间的亲缘关系，检测样本多，检测工作量大。因此，稳定性强、操作简便、重复性好、多态性高、技术易掌握的分子标记技术更适合草莓的遗传背景分析。ISSR标记结合了RAPD和SSR的优点，具有DNA模板用量小、实验成本低、操作简单的优点[14]，同时还兼具多态性丰富、稳定性高的优良特性[15]，因此，本研究采用ISSR技术开展草莓的遗传背景分析。

图4 草莓试验材料的多维尺度分析Fig.4 Multidimensional scaling analysis of strawberry trial materials

利用ISSR标记分析草莓种质材料的遗传背景，关键是找到适合的ISSR引物。本试验筛选出的10条ISSR引物，并获得了扩增条带的多态性“0-1”数据，经过统计分析发现草莓各品种的遗传相似系数和遗传距离的分析结果一致，系统聚类分析和多维尺度分析结果一致，亲本之间、亲本与杂交后代之间、亲本与其组培变异株之间的遗传距离、遗传相似系数、聚类结果和多维尺度分析结果均较好地反映出了试验材料间的亲缘关系。因此，遗传距离、遗传相似系数、系统聚类和多维尺度分析相结合，可以全面地分析草莓杂交品种及其亲本的遗传背景。根据试验结果，发现未知遗传背景的草莓品种白雪公主与红颜和章姬亲缘关系最近，推测白雪公主的亲本材料里有红颜和(或)章姬。ISSR分析结果显示各草莓品种间平均相似系数较高，表明采集草莓品种间遗传背景单一，且多数有日本草莓品种的遗传背景，但是日本草莓品种的品质较好，但一般抗病性较差[16]，这种现象如果不改变，不仅育成草莓新品种难有较大的突破，也增加了草莓抗病育种的难度。

4 结 论

草莓ISSR遗传背景分析表明我国的草莓品种与美国、西班牙的品种亲缘关系较远，与日本品种的亲缘关系很近，且遗传背景比较狭窄，品种之间的遗传差异也较小。因此，拓宽草莓遗传背景、增加草莓品种遗传多样性，将成为我国草莓生产、种质资源创新和育种工作的重要任务。