甘蓝蚜和萝卜蚜OBP和CSP的生物信息学分析

李文红，程 英，金剑雪，周宇航，李凤良

(贵州省农业科学院植物保护研究所，贵阳 550006)

【研究意义】我国十字花科蔬菜上发生的蚜虫主要有桃蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]、甘蓝蚜[Brevicorynebrassicae(L.)]和萝卜蚜[Lipaphiserysimi(Kaltenbach)]等[1-2]。菜蚜分布广、繁殖快、危害重，加之传播病毒病，常使蔬菜产量、品质和食用价值显著下降。化学防治为当前防控菜蚜的主要手段，然因其容易导致田间抗药性、农药残留等问题，亟需开发绿色可持续的防控措施。【前人研究进展】气味结合蛋白(Odorant binding protein，OBP)和化学感受蛋白(Chemosensory protein，CSP)是两类水溶性的小分子蛋白家族，是昆虫化学感受过程中信息素和气味的识别载体[3-5]。化学感受在蚜虫取食、交配、繁殖、驱避天敌等生命活动中发挥重要作用。蚜虫依赖化学信号(如植物的挥发物和种内特异的信息素)精准定位寄主、选择配偶和避免天敌等[6]。研究蚜虫与蚜虫、植物、天敌、竞争者和互利者之间的互作将有助于探究新的环境友好型防治策略。目前,随着组学技术的发展，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)、棉蚜(Aphisgossypii)、麦长管蚜(Sitobionavenae)和桃蚜(M.persicae)等蚜虫的多个OBP和CSP基因已被鉴定[7-10],桃蚜中发现9个OBP基因和9个CSP基因，甘蓝蚜中只鉴定OBP3基因序列，萝卜蚜中只鉴定出OBP3和OBP7基因[10]。【本研究切入点】为丰富甘蓝蚜和萝卜蚜的OBP和CSP基因序列，通过生物信息学方法，基于已公开上传的甘蓝蚜和萝卜蚜的SRA转录组数据，对甘蓝蚜和萝卜蚜的OBP和CSP基因进行鉴定。【拟解决的关键问题】对3种菜蚜(桃蚜、甘蓝蚜和萝卜蚜)的OBP和CSP基因进行序列比对和结构分析，为菜蚜气味识别和化学感受相关研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 甘蓝蚜和萝卜蚜本地转录组数据库的建立

桃蚜OBP和CSP基因鉴定已有报道，故本文拟通过生物信息学鉴定甘蓝蚜和萝卜的OBP和CSP基因。在NCBI网站下载SRA转录组数据SRX2355992(甘蓝蚜，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRX2355992)和SRX2362226(萝卜蚜，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRX2362226)，然后进行从头组装和注释。采用Trimmomatic软件(http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/ Trimmomatic)对原始测序数据(raw data)进行接头序列的去除和序列的过滤以得到高质量的测序数据(clean data)。采用Trinity 软件(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)对clean data进行从头组装。针对拼接得到的unigene序列，使用BLASTX比对(BLAST+ 2.7.1，比对标准：E≤10-5)NR、string、KEGG数据库，进行基因功能注释，建立甘蓝蚜和萝卜蚜本地转录组数据库。

1.2 甘蓝蚜和萝卜蚜OBP和CSP基因序列的挖掘

基于报道的豌豆蚜和桃蚜OBP和CSP基因的氨基酸序列[7，10-11]，采用Bioedit软件的本地BLAST程序，在甘蓝蚜和萝卜蚜本地转录组数据库中进行tBLASTn查找可能的甘蓝蚜和萝卜蚜OBP和CSP基因的核酸序列，再采用ExPASy在线翻译网站(https://web.expasy.org/translate/)预测对应的氨基酸序列，用于下一步构建进化树和序列比对分析。

1.3 多序列比对、Motif分析和进化树构建

采用ClustalX软件对多个序列进行比对(参数选择为默认设置)；采用Genedoc软件[12]对比对的结果进行手动编辑、结果显示设置以及序列间相似度计算；采用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)预测蛋白N端是否含有信号肽。采用MEME在线网站(http://meme.sdsc.edu)对所有OBP和CSP序列进行Motif分析，参数设置为最小宽度=5、最大宽度=10、查找Motif最大数目=8。采用MEGA 7.0.26 软件[13]的邻位相邻算法(Neighbor-joining method)构建系统进化树，bootstrap分析重复数为1000，替换方法为poisson model，其它参数选择为默认设置。

1.4 3种菜蚜OBP三维结构同源建模

采用NCBI的PSI-BLAST在线程序在蛋白组三维结构数据库(Protein Data Bank)中对3种菜蚜OBP和CSP序列进行查找。采用SWISS MODEL在线服务器(https://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模，参数选择为默认设置。采用DeepViewer 软件(SWISS-PdbViewer,https://spdbv.vital-it.ch/)对三维结构进行显示设置。

2 结果与分析

2.1 3种菜蚜OBPs和CSPs基因的鉴定

通过对建立的甘蓝蚜和萝卜蚜本地转录组数据进行BLAST查找，得到甘蓝蚜12个OBP基因和8个CSP基因序列，萝卜蚜12个OBP基因和12个CSP基因序列；基于Wang[10]和Filipe[11]报道的桃蚜OBP和CSP基因序列以及豌豆蚜OBP和CSP基因序列，通过序列比对和BLAST查找，共得到桃蚜13个OBP基因和9个CSP基因序列。同样基于Zhou[7]和Filipe[11]报道的豌豆蚜OBP和CSP基因序列，通过序列比对和NCBI在线BLAST核对，共得到豌豆蚜17个OBP基因全长序列和10个CSP基因全长序列(表1)。

2.2 甘蓝蚜、萝卜蚜、桃蚜和豌豆蚜OBPs和CSPs基因的序列比对和系统进化分析

通过多序列比对和系统进化树分析(图1～4)发现，3种菜蚜甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜OBP和CSP基因序列在豌豆蚜中均有相对应的直系同源基因，因此参考豌豆蚜的OBP和CSP基因命名对3种菜蚜OBP和CSP基因进行命名(表1)。序列比对结果表明，直系同源基因在3种菜蚜之间相似度较高，3种菜蚜的OBP2、OBP3、OBP4、OBP5、OBP8和OBP13相似度均在90%以上；但相同物种的不同OBP基因间相似度较低，均不超过30%(表2，图1)。3种菜蚜的CSP2、CSP4、CSP5、CSP6和CSP7的相似度都在90%以上，但相同物种的不同CSP基因间相似度较低，均不超过40%(表3，图2)。从4种蚜虫(甘蓝蚜、萝卜蚜、桃蚜和豌豆蚜)OBP和CSP基因的系统进化树中也发现类似特征(图3～4)，即直系同源基因的同源性高，而不同基因的同源性较低，分化程度高。

表1 桃蚜、甘蓝蚜和萝卜蚜转录组中鉴定得到的OBPs和CSPs

图中灰色标示半胱氨酸，倒三角和黑框标示保守半胱氨酸模式序列Highlights with gray color indicates show cysteines,inverted triangles and black box indicate conversed cysteine pattern sequences.图1 甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜的OBP基因序列比对Fig.1 Sequence comparison of OBP genes of B.brassicae,L.erysimi and M.persicae

三角标示保守半胱氨酸模式序列，黑底白字显示相似度100%的氨基酸位点，灰底白字显示相似度80%的氨基酸位点Inverted triangles indicates conversed cysteine pattern sequence, white letters with black shading indicates amino acid sites with 100% similarity and white letters with gray shading indicates amino acid sites with 80% similarity图2 甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜CSP基因序列比对Fig.2 Sequence comparison of CSP genes of B.brassicae,L.erysimi and M.persicae

2.3 保守序列分析和Motif预测

通过SignalP 5.0在线网站预测豌豆蚜和3种菜蚜(甘蓝蚜、萝卜蚜、桃蚜)OBP和CSP基因序列的信号肽发现，除MperOBP13、MperOBP16、BbraOBP10、BbraOBP13、LeryOBP13、BbraCSP8、LeryCSP8和LeryCSP9外，其余序列的N端均有信号肽。3种菜蚜的OBP1-3、OBP7-12和 OBP14-17属于Classic OBPs，具有Classic OBPs的半胱氨酸模式识别序列：C1-X22-34-C2-X3-C3-X41-46-C4-X7-13-C5-X8-C6。OBP4也属于Classic OBPs，但是在C1和C2之间有49个氨基酸；OBP5和OBP6属于Plus-C OBPs，除Classic OBPs的6个保守半胱氨酸，C6下游还有额外的1～2个半胱氨酸和C6下游相邻的保守位点脯氨酸(图1)。OBP13中的半胱氨酸特征缺少Classic OBPs的C1，但是C端多了一个C7(图1)。而3种菜蚜CSP基因的保守半胱氨酸模式识别序列较一致：C1-X6-C2-X18-19-C3-X2-C4。序列比对发现(图2)，CSP基因除了4个保守半胱氨酸位点之外，还有9个保守氨基酸位点。

图3 甘蓝蚜、萝卜蚜、桃蚜和豌豆蚜OBP基因的系统进化树和Motif分析Fig.3 Phylogenetic tree and Motif analysis of OBP genes of B.brassicae, L.erysimi, M.persicae and A.pisum

保守基序(motif)是功能性结构域的主要元件。采用MEME预测出的蚜虫OBPs的8个motifs中，仅3个motifs(Motif 1、Motif 2和Motif 4)出现在所有OBP基因中(图3)。Motif 1和Motif 2中都含有2个半胱氨酸，分别为Classic OBPs的C2-C3和C5-C6，Motif 4和Motif 6中含有1个半胱氨酸。这些motif特征表明蚜虫OBPs不同基因间序列差异较大。3种菜蚜CSP基因的8个预测motifs中，有5个motifs(Motif 1～5)出现在所有CSP基因中(图4)，其中CSP1、CSP2、CSP4、CSP5、CSP6的motif排序完全相同(6-4-1-5-2-8-3-7)。在系统进化树上也发现此5个CSP基因和CSP10聚在一起。表明，相对OBP基因，蚜虫CSP不同基因间序列分化程度较低。

图4 甘蓝蚜、萝卜蚜、桃蚜和豌豆蚜CSP基因的系统进化树和motif分析Fig.4 Phylogenetic tree and motif analysis of CSP genes of B.brassicae,L.erysimi,M.persicae and A.pisum

2.4 蛋白质三维结构预测

通过PSI-BLAST对每个蚜虫OBP和CSP序列的同源三维结构模板进行查找发现，仅蚜虫OBP3有较高相似度的三维结构模板，即文献报道的莴苣蚜(Nasonoviaribisnigri)和巢菜修尾蚜(Megouraviciae)的OBP3晶体结构[14]。基于M.viciaeOBP3晶体结构模板(PDB数据库编号：4z39)，同源构建了3种菜蚜的OBP3蛋白三维结构(图5)，发现其三维结构相似度极高，推测OBP3在3种菜蚜中与气味小分子结合的功能可能相似。

表2 甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜OBP基因之间的相似度

表3 甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜CSP基因之间的相似度

图5 豌豆蚜、甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜OBP3蛋白的三维结构重叠Fig.5 Superposition of 3D structures of OBP3 protein of A.pisum,B.brassicae,L.erysimi and M.persicae

3 讨 论

随着组学技术的快速发展，越来越多的昆虫OBP和CSP基因被鉴定出来。Zhou[7]鉴定了15个豌豆蚜OBP基因序列和13个CSP基因序列。其中豌豆蚜OBP1-11和CSP1-10基因序列为全长序列。将剩余OBP片段序列进行NCBI在线BLAST查找，新增全长序列OBP12和OBP13；Filipe[11]文章附件中的豌豆蚜OBP14、OBP15和OBP19基因序列与已鉴定的全长序列完全重复，且附件中豌豆蚜OBP16和OBP17为完全重复序列[11]，本研究将其重新命名为ApisOBP14。通过BLAST查找，在NCBI数据库中发现1个与ApisOBP14相似度比较高的基因序列(登录号：XP 003245156)，将其命名为ApisOBP15。Filipe[11]文章附件中OBP18序列是不完整的拼接序列，本研究在NCBI找到其全长序列(XP_016659328)，将其命名为ApisOBP17。本研究命名的ApisOBP16(XP_016656015)是从NCBI找到的1个桃蚜新OBP基因的同源基因(XP_022178221)。Wang[10]共鉴定出9个桃蚜OBP基因和9个桃蚜CSP基因。本研究基于豌豆蚜ApisOBP1-17基因序列和NCBI注释为OBP的桃蚜基因序列，进行序列比对和进化树分析新鉴定出的4个桃蚜OBP基因(MperOBP14-17)在豌豆蚜中都有直系同源基因存在；同样，鉴定得到的甘蓝蚜12个OBP基因和8个CSP基因序列以及萝卜蚜12个OBP基因和12个CSP基因序列，在豌豆蚜和桃蚜中都有其直系同源基因。以上表明，蚜虫同类型的OBP和CSP基因种间相当保守。

本研究并未找到桃蚜、甘蓝蚜和萝卜蚜中CSP3、OBP1、OBP11、OBP12和OBP17的同源基因。在桃蚜中有豌豆蚜OBP16的同源基因，但在甘蓝蚜和萝卜蚜中并未发现。CSP3和OBP1同源基因在棉蚜A.gossypii中也未发现[8]，推测这些基因很可能在蚜虫进化过程中丢失[10]。

序列比对和进化树分析表明，蚜虫不同OBP和CSP之间相似度很低，提示其与配体结合的多样性。迄今为止，在蚜虫中仅少数OBP(如OBP3和OBP7)的功能和与气味分子结合活性被研究报道[15-19]。豌豆蚜OBP3和OBP7可以与报警信息素主要成分E-β-法尼烯(E-β-famesene，Eβf)有较高的结合活性。多数蚜虫可分泌和释放Eβf，当受到寄生物或捕食者的攻击等外在压力时，警告相近的同类蚜虫逃离。报警信息素可以与化学杀虫剂联合使用以有效控制蚜虫危害，减少杀虫剂的使用量及抗性的产生，有利于生态环境保护。Sun[20]将Eβf与OBP3结合区域的基团与噻虫啉的杀虫基团融合，成功合成了对蚜虫具驱避和杀虫的双重作用的化合物。

目前，蚜虫中除了OBP3和OBP7等少数OBP，蚜虫其它的OBP和所有CSP的基因功能未见报道。本研究通过生物信息学方法鉴定得到甘蓝蚜和萝卜蚜的OBP和CSP基因序列，为未来开展菜蚜气味识别和化学感受相关实验和应用提供参考。

4 结 论

研究基于甘蓝蚜和萝卜蚜的公共转录组数据，利用BLAST查找和序列比对鉴定出12个甘蓝蚜OBP基因、8个甘蓝蚜CSP基因、12个萝卜蚜OBP基因和12个萝卜蚜CSP基因序列；通过与桃蚜和豌豆蚜进行序列比对和系统进化树分析发现四种蚜虫OBP和CSP直系同源基因的同源性高，但相同物种的不同OBP和CSP基因间相似度较低；基于保守半胱氨酸序列分析和Motif特征分析发现甘蓝蚜、萝卜蚜和桃蚜CSP基因比OBP基因更保守；利用同源建模方法发现甘蓝蚜、萝卜蚜、桃蚜和豌豆蚜OBP3蛋白三维结构极其相似。