SD大鼠癫痫发作后海马区Wnt3a、p-β-catenin和β-catenin的表达变化

刘 平，程莹莹，蔡海燕，杨 森，武建军，丁银秀，3

（1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖学系，银川 750004；2.宁夏回族自治区人民医院神经内科，银川 750001；3.宁夏回族自治区医学科学研究所，银川 750004）

颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫[1]。癫痫发作时引起的海马神经发生与癫痫易感性、继发性海马功能障碍等密切相关，其具体机制不明。研究[2-3]证实，反复的癫痫发作或癫痫持续状态（status epilepticus，SE）下，严重影响动物的学习记忆等认知功能，且癫痫发作后引起海马萎缩和苔藓样出芽，进一步加重了动物认知功能减退。经典的Wnts/β-catenin信号通路是参与脑内神经发生、癫痫形成的关键途径[4]。因此，阐明癫痫发作时海马神经发生与Wnts/β-catenin信号网络调控机制的关系，对癫痫的靶向防治尤为重要。本实验以SD癫痫大鼠为研究对象，探讨SD大鼠癫痫发作后海马区胶质纤维状酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、Wnt3a、p-β-catenin和β-catenin表达的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取体质量为150～180 g的雄性SPF级SD大鼠32只，由宁夏医科大学实验动物中心提供。动物饲养室内的温度保持在20℃左右，相对湿度恒定（45%～55%）。常规摄食、饮水，让大鼠适应环境3 d后，进行后续的实验。将大鼠随机分为正常对照组（Con组）、癫痫模型组（SE 1 d、SE 7 d和SE 14 d）共4组，每组SD大鼠8只。

1.2 主要试剂和仪器

氯化锂、匹罗卡品购自Sigma公司；兔抗GFAP、兔抗Wnt3a、兔抗p-β-catenin和兔抗β-catenin购自Abcam公司；总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒以及相应的HRP二抗购自凯基生物公司；高速冷冻离心机购自Thermo Fisher公司，Amersham Imager 600凝胶成像系统购自GE医疗公司。

1.3 方法

1.3.1 癫痫大鼠模型的制备及效果评价 采用国际公认并广泛使用的腹腔注射氯化锂-匹罗卡品（lithium-pilocarpine）动物模型制备方法：癫痫模型组大鼠腹腔注射氯化锂（3 mmol·kg-1），18～20 h后腹腔注射匹罗卡品（30 mg·kg-1）；Con组大鼠注射0.9%生理盐水（3 mmol·kg-1）。实验动物癫痫发作分级评价标准采用Racine分级标准（0级为无抽搐发作；Ⅰ级为面部阵挛；Ⅱ级为节律性点头发作；Ⅲ级为单侧前肢抽搐；Ⅳ级为双前肢抽搐；Ⅴ级为四肢抽搐或失去平衡、跳跃并跌倒等）。若动物出现Ⅳ级及以上症状且发作45～60 min，则证明造模成功，立即注射水合氯醛（10 mg·kg-1），终止发作。

造模后注意大鼠保暖、保持呼吸道通畅、提供足够的饮水及食物。造模后第1天，密切观察大鼠饮水、进食次数和进食量是否正常，将SE 1 d组大鼠处死，取脑备用；造模后第2天和第8天，SE 7 d组和SE 14 d组大鼠分别进行水迷宫实验。在此过程中，观察大鼠癫痫小发作或大发作的持续时间或频次，且在各组相应的时间节点处死大鼠，取新鲜脑组织-80℃冰箱保存。

1.3.2 水迷宫实验 水迷宫由一直径为180 cm的圆形塑胶桶、摄像头及透明站台组成，水池分为第一、二、三、四象限，将平台放置于第三象限中心位置。从第一象限开始作为大鼠入水点，依次放入水中，每天上午、下午分别进行一次实验。共训练5 d，每个象限60 s，记录4个象限中大鼠的逃避潜伏期，第6天记录大鼠定位巡航的路程，巡航实验结束后记录大鼠首次穿越平台的时间和60 s内穿越平台的次数。

1.3.3 Western blot实验 将大鼠麻醉后，断头取脑，大部分新鲜脑组织-80℃冰箱保存备用。取小部分海马组织提取总蛋白，进行蛋白电泳，转膜，封闭。入一抗，分别是：兔抗GFAP（1∶20 000）、兔抗Wnt3a（1∶1 000）、兔抗p-β-catenin（1∶500）和兔抗β-catenin（1∶10 000），4℃摇床过夜，次日入相应的HRP二抗1～2 h。凝胶成像仪采集图像，进行蛋白条带灰度分析。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的行为学改变

癫痫模型组SD大鼠腹腔注射氯化锂-匹罗卡品后，早期发现大鼠有点头、面部、肢体抽搐、流涎等症状，进而出现后腿站立、前腿抬起并且出现跌倒、全身抽搐强直等癫痫持续状态的行为学改变。Con组大鼠未观察到以上的异常行为学改变。与Con组比较，癫痫模型组大鼠精神萎靡或躁狂不安、活动减少、进食饮水量减少、体质量增加缓慢或未增加。

2.2 水迷宫实验结果

2.2.1 定位巡航实验 与Con组比较，SE 7 d组、SE 14 d组大鼠第2～5天逃避潜伏时间增长，SE 14 d组大鼠第3～5天逃避潜伏时间短于SE 7 d组（P均＜0.05），见图1A。与Con组比较，SE 7 d、SE 14 d组大鼠60 s内定位巡航的路程增长，SE 14 d组大鼠60 s内定位巡航的路程较SE 7 d组短（P均＜0.05），见图1B。

2.2.2 空间探索实验 与Con组比较，SE 7 d组大鼠首次穿越平台所用时间延长，SE 14 d组大鼠首次穿越平台所用时间较SE 7 d组少（P均＜0.05），见图1C。与Con组比较，SE 7 d组、SE 14 d组大鼠在60 s内穿越平台的次数减少，SE 14 d组大鼠在60 s内穿越平台的次数多于SE 7 d组（P均＜0.05），见图1D。

图1 各组大鼠学习和记忆能力的变化情况

2.3 各组大鼠海马区GFAP和Wnt3a蛋白含量的变化

蛋白分析结果发现，SE 7 d组、SE 14 d组大鼠GFAP和Wnt3a蛋白灰度值均较Con组和SE 1 d组增加，SE 14 d组大鼠GFAP和Wnt3a蛋白灰度值高于SE 7 d组（P均＜0.05），见图2。

图2 各组大鼠海马区GFAP和Wnt3a蛋白含量的变化

2.4 各组大鼠海马区p-β-catenin和β-catenin蛋白含量的变化

Western blot蛋白分析结果显示，与Con组和SE 1 d组比较，SE 7 d组、SE 14 d组大鼠p-βcatenin蛋白含量均减少，β-catenin蛋白含量增加（P均＜0.05）；SE 14 d组大鼠p-β-catenin蛋白含量少于SE 7 d组，β-catenin蛋白含量高于SE 7 d组（P均＜0.05），见图3。

图3 各组大鼠海马区p-β-catenin和β-catenin蛋白含量的变化

3 讨论

癫痫是神经系统最常见的疾病之一。近年来新型抗癫痫药物的不断问世，对癫痫患者有一定的治疗效果，但仍有约30%的癫痫最终转化为难治性癫痫。颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫，占难治性癫痫的50%～70%[1]。研究[5-6]表明，海马与大鼠的学习记忆等认知功能密切相关，海马硬化是颞叶癫痫最常见的病理改变，其基本特征为反应性星形胶质细胞异常增生和苔藓纤维出芽。癫痫发作后反应性星形胶质细胞异常激活，促进了海马神经发生的增强[7]。GFAP特异地表达于中枢神经系统星形胶质细胞的胞质内，可以作为星形胶质细胞的特异性标记物。本研究以腹腔注射氯化锂-匹罗卡品成功建立癫痫动物模型，通过蛋白电泳实验结果发现，SE 7 d组和SE 14 d组癫痫大鼠海马GFAP蛋白表达水平升高，在癫痫早期（1～14 d），其蛋白表达量随时间的延长呈上调趋势，提示当癫痫发作后反应性星形胶质细胞异常激活，与有关报道[7]一致。水迷宫实验结果显示，癫痫大鼠的学习记忆能力较Con组大鼠差。在定位巡航实验中，SE 7 d组、SE 14 d组大鼠逃避潜伏期和巡航路程均较长；空间探索实验中，在60 s内SE 7 d组、SE 14 d组大鼠首次通过平台的时间延长，且穿越平台的次数减少。以上结果提示癫痫发作后影响海马神经发生，促使大鼠的学习记忆能力下降，这可能与其神经元丢失、减少及异常放电等多个因素密切相关[8]。

经典的Wnts/β-catenin信号通路是神经发生所必需的保守的发育性信号通路[9]，在创伤性脑损伤后，Wnt信号通路的关键分子被激活，与神经元存活和稳态相关的多种基因，如Bcl-1、Cyclin D1和c-myc表达上调，并且涉及这个信号通路的相关基因的变异和失活，最终导致海马神经发育不全和整个大脑畸形，从而诱发癫痫等神经系统疾病的发生。β-catenin在维持机体正常生理功能中起着重要的作用，癫痫发作时β-catenin分子表达含量增高，增多的β-catenin进入细胞核内，刺激细胞的增殖[10]。Wnts蛋白，尤其是Wnt3是神经发生的关键调控因子。实验[11]表明，Wnt3a由周围细胞分泌，并与靶细胞表面的Frizzled受体和共受体Lrp5/6结合，在Wnts分子通道关闭的情况下，细胞质中的Axin/APC/GSK-3β蛋白复合物使β-catenin磷酸化，胞内β-catenin维持在较低水平，其不能进入核内参与细胞的增殖和分化过程。有研究[12]发现，癫痫急性期引起神经细胞的生长异常增多，提示抑制急性期海马神经发生可能降低癫痫的发生、发展过程，同时反馈调节Wnt信号通路的关键分子可能有助于缓解癫痫的发作。本研究发现，SD大鼠癫痫发作后Wnt3a和β-catenin蛋白表达含量增高，且在癫痫发作早期随时间的延长有上调趋势。但p-β-catenin蛋白含量在癫痫发作早期无明显变化，SE 14 d组p-β-catenin蛋白含量低于Con组，提示在癫痫发作后，Wnt信号通路的关键分子Wnt3a被激活，β-catenin磷酸化过程受抑制，胞内游离的β-catenin含量增高，从而转入核内，参与细胞的增殖和分化进程。对于Wnt信号通路上关键分子的表达上调或下调是否对认知、记忆、精神等产生影响还需要进一步研究证实。

综上所述，癫痫发作后大鼠学习记忆能力下降，大鼠海马GFAP、Wnt3a、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表达异常。因此推测Wnts/β-catenin信号通路可能参与调控癫痫的发生、发展，至于Wnts/β-catenin信号通路如何发挥作用仍需进一步深入研究。