产气荚膜梭菌群体感应系统研究进展

贺 曦，冶贵生

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，Cp)是一种可产芽孢、形成生物被膜的革兰氏阳性条件致病菌，普遍存在于自然环境中，尤其是在人和动物肠道内、土壤中。Cp通过产生20多种毒素及胞外酶，引起牛、羊、鸡等畜禽的肠道和组织感染，导致胃肠道综合征、肠毒素血症[1-2]、气性坏疽[3]、组织毒性感染[4-5]，另一方面Cp可引起人类食物中毒[6]。先前研究表明，Cp不仅能单独引起感染，且不同源Cp之间可联合感染，还能与其他常见致病菌混合感染，致病后发病快、病程短、发病率和死亡率都极高[7]。Cp感染对畜牧业发展危害严重，更是引起人类患气性坏疽的主要病原菌，引起各界广泛关注。不少学者通过对其致病性进行研究，发现Cp存在调控毒素分泌和生物膜形成等致病相关基因的群体感应系统。

群体感应(Quorum Sensing，QS)是细菌进行不同细胞间通信的过程，细菌通过感应周围环境中信号分子的浓度，来感知周围细菌密度，当浓度达到一定阈值时，进一步来调节自身生理行为，在细菌浓度低时不具备该特征。QS系统这一概念于1994年被Fuqua等[8]首次提出，后续研究证明在革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌中均存在该系统，如金黄色葡萄球菌中的Agr系统[9]、铜绿假单胞菌中的las系统[10]、白色念珠菌中以金合欢醇(Farnesol)为信号分子的QS系统等[11]。研究发现，QS系统与细菌的生长繁殖、生物膜形成、毒素分泌和生物发光等生理活动密切相关，也是细菌致病必不可少的系统之一。本文将主要介绍Cp中已发现的QS系统类型、不同QS系统对该菌毒素分泌和生物膜形成等致病相关因子的调控作用。以期为Cp QS系统的调控机制提供系统性认识，同时可进一步为制定该致病菌感染所引发的相关疾病预防措施提供研究方向。

1 产气荚膜梭菌的群体感应系统

Cp作为革兰氏阳性条件致病菌，至少存在两种QS系统，目前发现的有Agr系统和LuxS/AI-2型QS系统。Agr系统通常是一个包含4个基因的操纵子，主要参与调控细菌毒素的表达[10]、毒力因子的产生以及生物膜的形成等[12]。Cp的Agr(CpAL)系统同样包含4个基因[13-14]，其中研究较多的为编码AgrB膜转运蛋白和编码AgrD肽(信号肽前体物质)的基因[15]，该系统操纵子中的另外两个上游基因功能尚不清楚，有待进一步研究。CpAL系统的agrB、agrD基因与其他革兰氏阳性菌同源[16]，且在不同型Cp分离株也已证实了这两个基因的存在[17]。CpAL系统以自诱导肽(Autoinducing peptides，AIP)作为信号分子，首先由agrD基因编码合成AIP前体肽，该肽转运至细胞膜经agrB基因编码的跨膜蛋白加工、修饰成具有活性的AIP信号分子[18]，然后分泌到胞外，在胞外累积达到一定阈值激活下游通路，进而调控下游基因表达。Ma等[19]通过对比不同细菌产生的AIP分子结构发现，不同细菌产生的AIP分子间存在结构差异，CpAL系统产生的AIP分子是一个无尾的五元硫代内酯环[20]，与金黄色葡萄球菌产生的AIP分子有所不同，但目前对不同型Cp所产生的AIP分子详细结构描述较少，各菌株间AIP分子的比较目前尚未见报道，推测不同型Cp产生的AIP分子也可能存在种内差异。

Cp的另一个QS系统是以自诱导物-2(Autoinducer 2，AI-2)为信号分子的LuxS/AI-2系统，该系统首次发现于哈维氏弧菌中[21]，是革兰氏阳性和阴性细菌共有的，被认为是实现细菌跨物种交流的媒介。AI-2信号分子是甲基循环中的副产物，其生物合成途径高度保守，由LuxS蛋白催化合成前体物4,5-二羟基-2,3-戊二酮[(4S)-4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD]，DPD通过化学键的重新排列形成不同构象的AI-2分子[22]，因此AI-2是指几种不同构象的小分子混合物。另外，不同细菌中AI-2的受体不同，一种细菌所产生的AI-2分子能自发环化成可被其他细菌识别的活化形式，这证实了LuxS/AI-2系统可以实现细菌的种间交流。该系统在细菌中广泛存在，参与细胞代谢，对致病菌的许多重要毒性因子表达都存在调控作用，对Cp也具有重要调控作用。

2 产气荚膜梭菌QS系统的调控机制

Cp的QS系统并不是单独作用的，常与其他系统联合调控多种外毒素的分泌、生物被膜的形成、芽孢的产生、菌毛的活动及滑动运动等生物学性状。研究表明，CpAL系统通常与双组份系统协同发挥作用，LuxS/AI-2系统则可通过影响代谢相关基因表达而影响毒力因子的表达。Cp的两个QS系统对毒力相关因子的调控机制错综复杂，并且存在相互交叉的影响，目前具体的机制尚未明确，仍需大量的科学实验证实各系统间的级联关系。最近的研究强调了CpAL系统与LuxS/AI-2系统在调节毒素产生和毒力方面的重要性。本文重点对这两个系统调节毒力相关表达的调控进行讨论。

2.1 Cp QS系统对毒素因子的调控 CpAL系统与LuxS/AI-2系统均对其毒力相关基因的表达具有调控作用，其中CpAL系统是该菌毒力产生最重要的调控系统[23]，与VirS/VirR双组份系统协同作用，参与调节Cp菌大多数外毒素的产生[24]，包括CPA、PFO、CPB、CPB2、CPE、ETX、NetB毒素的生成[25-26]，此外，该系统还可通过调节肠道内的CPB毒素水平，在兔回肠袢中引起坏死性肠炎[27]。另有资料显示，不同型菌株的CpAL系统对毒力因子的调控有所不同，早期的研究证明CpAL系统参与调节A型、C型及D型Cp所有毒素的产生，近年来发现该系统在B型和G型Cp中也存在调控作用。不同的是，B型Cp的ETX产量不受CpAL系统的影响，而D型菌株的ETX产量受CpAL系统的影响[28]。事实上，CpAL系统对不同型菌株毒素表达的调控机制复杂，尽管这些菌株具有相同的调节基因和毒素基因，但它们之间的调控也存在一些差异，推测这种差异可能是由于不同型Cp中各类毒素的含量不同所引起的，具体因素还需更多的实验进行论证。

LuxS/AI-2系统参与调节Cp部分毒素的产生。其中AI-2分子作为种间通信重要的信号分子，luxS基因通过产生AI-2分子，调节Cp中毒素基因的表达。因此，luxS基因被认为是致病菌的治疗靶点[29]。Ohtani等[30]通过构建CpluxS缺失株，发现plc和colA基因的转录水平在对数早期被降低，而pfoA基因的转录水平在对数的早期至晚期均被降低，CPA等毒素的产生水平降低；并且luxS缺失株通过添加野生型上清液或大肠杆菌上清液，luxS突变体的pfoA转录水平恢复至野生状态。以上结果显示AI-2在Cp毒素产生中的重要作用，同时luxS基因可单独负责群体感应信号的转导。在A型Cp感染机体引起气性坏疽的过程中，LuxS/AI-2系统可正向调节CPA和PFO毒素的产生[31]，但该系统并不参与调节C型Cp引起的坏死性肠炎中CPB的产生[32]。针对不同Cp的LuxS/AI-2系统对不同毒素的调控不同，这将提示LuxS/AI-2系统在Cp感染中具有重要意义。

2.2 产气荚膜梭菌QS系统对生物膜形成的调控 生物膜(Biofilm，BF)指细菌通过分泌多糖基质和脂质蛋白等混合物黏附于接触表面，形成一个有机械稳定性的三维聚合网络，增强细菌在不利压力环境中的抵抗力，如有毒化合物的伤害、低营养环境[33]、致死剂量的抗生素[34]及其他不利条件[35]，是细菌为适应环境的一种生命现象。Cp生物膜形成的调节是一种复杂的机制，生物膜形成后极大地提高了该菌对抗生素和环境压力的耐受性，同时在生物膜结构中毒素基因的转录水平有所增加，从而增加了致病的可能性[36]。Aguayo-Acosta等[37]在对CpAL系统和LuxS/AI-2系统以及QS调节因子在控制生物膜形成的作用中发现，ΔagrB突变株中Agr系统相关基因在随后的几小时内表达下调，并且不能产生生物膜，但ΔluxS突变株生物膜的产生达到野生株水平，说明CpAL系统在生物膜形成过程中是非常重要的。在其他的研究发现，A型(S13)或C型(CN3685)Cp中，Δcpa和ΔpfoA突变体无法产生生物膜，基因回补后菌株恢复了生物膜形成的能力；而CN3685Δcpb对生物膜形成没有影响。因此，已经明确CPA和PFOA与Cp生物膜的形成具有相关性，CpAL系统可能通过调节毒素的分泌量，来影响生物膜的形成，推测其他毒素与生物膜形成也存在相关性。但目前对于Cp生物膜的结构尚未完全明确，未来还需要深入研究。

2.3 产气荚膜梭菌QS系统对其他表型的调控 QS系统还对Cp的一些毒力因子具有调控功能，如孢子形成、滑行运动等。孢子的形成在Cp的致病性中具有重要作用，它使致病菌在极端条件下能够存活。目前普遍认为孢子对Cp引起的气性坏疽、坏死性肠炎和食物中毒等疾病的传播具有重要性，同时对调节毒素的产生也很重要，其中CPE的合成发生在孢子形成期间。Cp孢子的形成是个复杂的过程，受多种机制的调控，CpAL系统能通过感应周围环境中的种群密度调控孢子形成[38]。在CpF5603中，agrB基因缺失后孢子形成减少约1 500倍，基因互补后孢子形成增加[39]。在F型菌株中，CpAL系统可诱导激活CPE进一步调控孢子形成[40]。但目前对于这方面的研究报道较少，可作为未来研究方向。

QS系统还参与调控Cp的运动，目前已明确由CpAL系统参与调控Cp滑动相关的分子机制。滑动运动是指细菌在感染组织上的快速发展，类似于滑动的运动[41]，是一种协调良好的主动运动机制，过程需消耗能量[42]。绝大多数梭菌具有鞭毛，并通过鞭毛产生运动，Cp由于缺乏鞭毛，仅依靠细菌细胞膜上的Ⅳ型菌毛在半固体介质表面滑动[43]，目前在可引起坏死性肠炎、气性坏疽及食物中毒的Cp中均发现了滑动运动[44-45]。滑动运动需要完整的CpAL系统，发现ΔagrB缺失株的滑动功能受损，基因回补后滑动能力恢复至野生水平[46]。另一方面，CpAL系统在转录水平上调节溶血素PFO和CPA的产生，并控制Cp的滑动运动，具有Agr系统缺陷的菌株不能滑动，也不能进行溶血[47]。以上证明PFO的产生与滑动运动之间存在直接相关性，CpAL系统作为中央调控网络将滑动运动与PFO的产生联系起来，这一结论也在金黄色葡萄球菌中得到验证[48]。目前Cp中各表型间调控机制尚未完全明确，关于滑动运动是否对其他毒素的转录具有影响还需深入研究。

3 小结与展望

Cp能引起多种病症，尽管一些Cp引起的胃肠炎可自行好转，但另一些菌株能引起严重疾病，甚至造成死亡，是造成临床上气性坏疽最多的病原菌。目前Cp在肠道、土壤、污水中均能被检测到，并且无有效治疗方案，给畜牧业发展及人类安全造成了潜在威胁。Cp能通过产生孢子抵御恶劣环境，形成生物膜增强粘附性和致病性，直接产生毒素引发疾病，QS系统作为Cp重要的调控系统之一，参与调控绝大部分致病相关生物学性状，为此研究该菌的QS系统具有重要意义。

鉴于上述的QS系统在Cp运动及毒力因子表达中的关键作用，抑制Cp的QS系统的功能，将有极大可能干扰该菌的运动性、黏附定植、以及致病性，从而达到抑制Cp感染的目的。因此，以QS系统为靶标，通过抑制其信号分子合成、系统中关键基因的表达都可能是抗Cp感染的一种潜在的治疗策略。但到目前为止，有关Cp的QS系统的研究还不够深入，尤其不同菌株产生的AIP分子的区别尚未明确，CpAL系统对其他毒素与生物膜形成的相关性也还未清楚，同时Cp的QS系统抑制剂相关的研究报道也较少，因此未来应致力于全面深入研究Cp的QS系统的调控，绘制完整的QS系统，为今后寻找安全有效的QS系统抑制剂，开发Cp新的抗感染疗法提供理论基础。

利益冲突：无