吉林省内花生衣药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定

马晓静 胡洋 李正刚 王丹彧*

（1.四平市食品药品检验所 吉林四平 136000；2.第964医院第二门诊部）

1 前言

黄曲霉毒素（AF）是黄曲霉菌寄生曲霉菌的次生代谢产物，广泛存在于动植物及土壤中，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为严重的一类霉菌毒素，花生、稻米、玉米、小麦等粮油类产品最易受其污染，严重影响人体健康。尤其是AFB1，具有极强的急性毒性和致癌性[1-5]。黄曲霉毒素因其强致癌性危害人体健康，故成为中药质量监测的一项重要指标。的检测为痕量分析，技术较为复杂近几年来，黄曲霉毒素备受关注。

目前，各地花生衣药材的来源不一，吉林省花生衣药材的主要来源为东北四粒红和白沙类，主要集中在松原市和四平市。由于花生衣的加工较为粗放，存在被黄曲霉毒素污染的风险，因此，本文采用免疫亲和柱净化HPLC法[6-12]，测定花生衣药材中黄曲霉毒素的含量，评估样品及加工过程的安全性，为吉林省花生衣药材的开发利用提供技术支持，以期为相关人员提供参考。

2 仪器与材料

高效液相色谱仪（Agilent 1260A，安捷伦公司）；光化学衍生器（KRC-25，青岛普瑞邦）；超声波清洗器（KQ-600E，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（125D-1CN，赛多利斯公司）。

黄曲霉毒素混合对照品（批号：610001-201804，AFB1含量0.93μg/ml，AFB2含量0.30μg/ml，AFG1含量0.93μg/ml，AFG2含量0.35μg/ml，中国食品药品检定研究院），甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

10批四粒红类花生衣和10批白沙类花生衣药材，均来自吉林省松原市和四平市的花生加工厂；吉林省企业提供2批，山东省企业提供1批，网购1批；其具体基原不明，经吉林农业大学中药材学院包海鹰教授鉴定为落花生Arachis hypogaea L.的干燥种皮。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，250×4.6 mm，5μm；流动相：甲醇-乙腈-水（40：20：40）；流速：0.8 mL/min；柱温：25℃。以荧光检测器检测，激发波长λex=360 nm，发射波长λex=450 nm。相邻的2个色谱峰的分离度＞1.5。

3.2 溶液的制备

3.2.1 黄曲霉毒素混合对照品溶液的制备

精密量取混合对照品溶液1 ml，置于20 ml量瓶中，加入70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，作为黄曲霉毒素对照品的贮备溶液。精密量取对照品贮备溶液2 ml，置于50ml量瓶中，加入70%甲醇的稀释至刻度，摇匀，即得黄曲霉毒素浓度依次1.9 ng/ml、0.6 ng/ml、1.9 ng/ml和0.7 ng/ml的混合标准品溶液。

3.2.2 供试品溶液的制备

精密称定经粉碎的花生衣药材（过2号筛）粉末15 g，置于均质瓶中；加入氯化钠2 g，精密加入70%的甲醇溶液75 ml，11 000 r/min高速搅拌2 min，5 000 r/min离心10 min；精密量取上清液15 ml，置于50ml的量瓶中；用水稀释至刻度，摇匀，5000r/min离心5 min；量取上清液20 ml，过免疫亲合柱，流速为3 m/min；使用20 ml的水洗脱，弃去洗脱液；让空气进入，将水挤出，用一定量甲醇进行洗脱；收集洗脱液，置于2 ml的量瓶中；加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，即得。

3.2.3 空白溶液

照3.2.2项下的制备方法，不加入样品，其它同法处理，即可。

3.3 系统适用性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，注入液相色谱，记录色谱图，得到黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的色谱峰，可见空白无干扰，见图1。

3.4 线性试验

精密量取3.2.1中的混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，记录峰面积；以进样量（ng）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

线性方程：AFB1Y=2960.7X-0.0288，r=1.000，线性范围：0.009 3 ng~0.046 5 ng；AFB2Y=7429.4X+0.3177，r=0.999 9，线性范围：0.003 0 ng~0.015 0 ng；AFG1Y=1163.5X+1.2988，r=0.999 9，线性范围：0.009 3 ng~0.046 5 ng；AFG2Y=4278.1X+0.5727，r=0.999 8，范围0.003 5 ng~0.017 5 ng。

3.5 检出限与定量限

3.5.1 检出限

取供试品粉末约15 g，精密加入黄曲霉毒素混合对照品贮备溶液50μl；按照3.2.2中的方法法操作，得到检出限供试品溶液；照3.1中的色谱条件测定色谱峰，并计算信噪比。

结果显示，AFB1的检出限为0.16μg/kg，S/N=5；AFB2的检出限为0.05μg/kg，S/N=4；AFG1的检出限为0.16μg/kg，S/N=7；AFG2的检出限为0.06μg/kg，S/N=7。

3.5.2 定量限

精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液1.5 ml，置于10 ml容量瓶中；加入甲醇稀释至刻度，精密量取50μl；加入供试品粉末约15 g，精密称定；按照3.2.2中的方法操作，得到定量限供试品溶液；按照3.1中的色谱条件测定色谱峰，计算信噪比。

结果显示，AFB1的检出限为0.5μg/kg，S/N=16；AFB2的检出限为0.2μg/kg，S/N=12；AFG1的检出限为0.5μg/kg，S/N=19；AFG2的检出限为0.2 μg/kg，S/N=20。

3.6 回收率试验

取批号为HSY-1的样品，粉碎（过2号筛），称取约15 g，共6份，精密称定；精密加入黄曲霉毒素混合对照品50μl，按照3.2.2的方法操作，得到供试品溶液；依照建立的方法测定供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的含量。

结果显示，黄曲霉毒素B1的平均收率为111%，RSD%=0.8%（n=6）；黄曲霉毒素B2的平均回收率为108%，RSD%=1.0%（n=6）；黄曲霉毒素G1的平均回收率为95%，RSD%=1.2%（n=6）；黄曲霉毒素G2的平均回收率为108%，RSD%=0.8%（n=6）。按照《中国药典》2015年四部分析方法的验证指导原则，回收率应为75%～120%，通过试验可知，本文测定方法的准确度满足方法验证要求。

3.7 样品测定

取花生衣样品，按照3.2.2项中的方法制备供试品溶液，按照3.1中的色谱条件进行测定，并根据标准曲线计算出供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，结果显示，24批样品中均未检出。

4 讨论

本文对《中国药典》2015年版中的黄曲霉毒素检测方法进行完善：通过对流动相比例的调整，改善对照品的分离度；通过改变溶剂，改善样量过大时对照品峰变型的问题；借助高速匀浆、免疫亲和柱净化，排除杂质干扰。试验结果证明，该方法的回收率良好。

花生衣药材的来源为食品落花生的种皮，检测食品中黄曲霉毒素的标准众多，限度不一，方法也不尽相同[13-14]。本文收集的24批样品中均未检出黄曲霉毒素，原因可能为：吉林省落花生的采收及加工时节多在每年10月份至次年2月，该时间段的温度和湿度均较低，使花生衣药材较为干燥容易储存，在加工和储运过程中不易受黄曲霉毒素污染。