根据CLSI EP09-A3文件对不同方法检测糖化血红蛋白A1c的可比性分析

李伟 李燕 马琳琳 黄茜北 吴文礼

作者单位：835000 新疆维吾尔自治区伊宁，新疆生产建设兵团第四师医院检验科

在发达国家和发展中国家，2型糖尿病及其相关并发症由于发病率和病死率升高，正日益成为严重的社会负担。预计2010年至2030年，发达国家和发展中国家的成人糖尿病患者数将分别增加约20%和69%。亚太地区已被确定为糖尿病发病的中心，因为该地区经历了快速的经济发展，伴随居民久坐的生活方式和营养不良，上述因素都增加了糖尿病的患病风险。仅在我国，糖尿病的发病率就从1980年的不足1%升高到2008年的近10%［1］。美国糖尿病控制与并发症试验（Diabetes Controls and Complications Trial，DCCT）以及英国糖尿病前瞻性研究组（United Kingdom Prospective Study of Diabetes，UKPDS）指出，在1型和2型糖尿病患者中，随着糖化血红蛋白A1c（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）水平降低，并发症的发生风险也有所降低。但是口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）和空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）不能准确反映患者的血糖控制情况［2］。HbA1c已被公认为一项准确可靠的指标，可用于糖尿病患者的诊断和血糖控制评估。该指标反映患者过去8～12周的平均血糖水平，与其他糖尿病诊断指标比较，HbA1c具有较少的分析前和生物学变异性，由于不需要空腹检测，因此对患者和临床医生较方便。目前临床实践和指南普遍认可以HbA1c作为确定患者是否达到或超出血糖目标的参考标准，同时为指导有关治疗方案变化提供决策［3］。美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）推荐糖尿病患者HbA1c目标为低于0.070，美国临床内分泌学家协会（American Association of Clinical Endocrinologists，AACE）推荐的HbA1c目标为低于0.065，国际临床化学联合会（International Federation of Clinical Chemistry，IFCC）推荐的HbA1c值为低于0.050。国际专家委员会（International Expert Committee，IEC）推荐当HbA1c水平高于0.065即可诊断为糖尿病［4］。目前，基于3种不同的分析原理（阳离子交换色谱法、亲和层析法和免疫比浊法）有超过20种不同的HbA1c测定方法，但有研究指出，不同的HbA1c检测方法在可比性及一致性上存在显著偏差，因此，不同检测方法所得HbA1c结果的可比性就成为一个重要问题［5］。本实验参考美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP09-A3文件，对新疆生产建设兵团第四师医院检验科采用的毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）与离子交换高效液相色谱法（ion exchange high-performance liquid chromatography，IE-HPLC）检测HbA1c的结果进行比较，旨在为临床提供准确和可靠的HbA1c检测结果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1样本来源 选择新疆生产建设兵团第四师医院的65例门诊及体检患者作为研究对象，使用含有乙二胺四乙酸二钾（dipotassium ethylenediamine tetra-acetate，EDTA-K2）的抗凝采血管采集患者静脉全血，在2～6 ℃冰箱中保存标本，尽可能在2 d内完成标本检测。HbA1c水平为0.004～0.016，且不同水平所占比例均符合EP09-A3文件要求。

1.2仪器与试剂 基于HPLC的ADAMSTMA1c HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪（日本爱科来株式会社）及原装配套试剂（批号：8K1321、8C1331、9C1366）、校准品（批号：HBA1C1209）和质控品（批号：水平1：33971；水平2：33972）；Capillarys 2 FLEX Piercing全自动高压液相毛细管电泳仪（法国赛比亚公司）及原装配套试剂（批号：15057/80、25106/01、13028/80）、校准品（批号：06115/07）和质控品（批号：水平1：58031，水平2：58032）。

1.3研究方法

1.3.1比对系统 ADAMSTMA1c HA-8180及配套试剂组成的HbA1c测定系统为参比系统（X），Capillarys 2 FLEX Piercing及配套试剂组成的HbA1c测定系统为待评系统（Y）。

1.3.2样本测定 根据EP09-A3文件要求，使用IE-HPLC法和CE法对收集的65份患者全血样本进行分析，每种方法对同一样本进行两次重复测定，并记录结果。在试验开始时校准参比和待评测量程序，以确保每个程序都符合所有质量控制（质控）参数。如有必要，按照仪器说明书或实验室操作规程重新校准参比或待评测量程序。

1.3.3可视化数据审查 依据EP09-A3文件要求，采用目测散点图、差异图以及广义极端学生化偏差法对65份患者样本检测结果进行异常结果（离群值）检查。

1.4统计学处理 应用MedCalc和GraphPad Prism 8统计软件处理数据。通过可视化数据审查，即目测散点图、差异偏差图、百分比差异偏差图、排序差异偏差图、排序百分比差异偏差图的具体特征，确定两种方法测定结果差异的变化，即恒定标准差（standard deviation，SD）、恒定变异系数（coefficient of variation，CV）、差值混合变化，选择最优的回归模型进行计算。

1.4.1检测异常结果（离群值） 根据EP09-A3文件要求，对离群值检测采用广义极端学生化偏差法。具体流程如下：① 设置显著性水平（α）用于检测异常值，其典型值为0.05或0.01；② 通过差异图或其他审查数据集的方式确定是否存在潜在的异常值，以样品例数的5%设置潜在异常值数量的上限（h），h＝N×5%，并四舍五入为整数；③ 对每个数据集，根据广义极端学生化偏差法确定一个或多个可疑结果是否在统计上被视为异常值；④ 计算CE法检测HbA1c结果（Y）与IE-HPLC法检测HbA1c结果（X）差值的平均值（-d） 和SD；⑤ 计算最大偏移值（extreme studentized deviate ，ESDi）［6］；⑥ 计算最大临界值（λi）［6］；⑦ 若ESDi≤λi，则认为该值为非离群值，再重复计算第2个ESDi和λi，直到ESDi＞λi，则认为该值为离群值，但最大不超过h个循环。

1.4.2方法学比较和偏倚评估 根据EP09-A3指南，绘制散点图、差异偏差图、百分比差异偏差图、排序差异偏差图、排序百分比差异偏差图和差异频数分布柱状图，判断CE法和IE-HPLC法测定HbA1c结果的分布规律，以及两种方法测定HbA1c结果间差异的变化特点，根据两种方法测定HbA1c结果的散点图和4种差异偏差图的具体特征，选择最合适的回归方程，计算医学决定水平处的偏倚及偏倚95%可信区间（95% confidence interval，95%CI），以偏倚值在95%CI范围内为可接受标准。

1.4.3临床可接受水平 根据中华人民共和国卫生行业标准《糖化血红蛋白检测》WS/T461-2015，推荐临床可接受水平为±0.5%，但控制在±0.3%为宜。

2 结果

2.1两种方法所得HbA1c结果比较 IE-HPLC法与CE法检测HbA1c的结果分别为0.081（0.065，0.114）和0.078（0.064，0.113），两者比较差异无统计学意义（Z＝0.222，P＝0.824）。

2.2离群值检测 采用广义极端学生化偏差法进行离群值检验，结果显示58、56、1、64号全血样品ESDi值均小于λi值，提示无离群值存在。见表1。

表1 广义极端学生化偏差法检验离群值计算结果

2.3数据作图

2.3.1散点图 以IE-HPLC法检测HbA1c的结果（Xi）为X轴，CE法检测HbA1c的结果（Yi）为Y轴绘制散点图，显示CE法和IE-HPLC法检测HbA1c结果紧密围绕在回归方程线性周围，差异表现为恒定SD，线性回归方程为Y＝-0.060 92+0.993 1X，r＝0.998，斜率b的95%CI为0.981 9～1.004 3（P＜0.000 1）。见图1。

图1 2种不同方法检测HbA1c结果散点图

2.3.2差异偏差图 根据EP09-A3指南，绘制差异偏差图时应考虑两个因素，第一个因素取决于试验者是否希望将参比方法视为与候选方法进行比较的真实值，或将两种方法的平均值视为样本真实值的最佳估计值。第二个因素是两种测量方法之间的差异可变性是恒定的还是与水平轴上的数值成比例的。综合考虑这两种因素，以IE-HPLC法检测HbA1c结果作为X轴，以毛细管电泳法与IE-HPLC法检测HbA1c结果的差值及其占IE-HPLC法检测HbA1c结果的比例作为Y轴，绘制差异偏差图和百分比差异偏差图。见图2。

图2 2种方法检测HbA1c的差异偏差图（2A）和百分比差异偏差图（2B）

2.3.3差值频数分布图 绘制2种方法测定HbA1c结果的差值频数分布图，结果显示差值频数分布呈非正态分布。见图3。

图3 2种方法检测HbA1c结果百分比偏差频数分布图

2.4结果比较与偏倚评估

2.4.1差异偏差图特征分析及相应的回归模型选择 根据EP09-A3指南要求，对65份患者全血标本的HbA1c结果绘制散点图、差异偏差图、百分比差异偏差图。CE法与IE-HPLC法测定HbA1c的结果差值变化为恒定SD，测定结果总体呈现线性变化趋势，r2≥0.95，因此选择普通线性回归（ordinary linear regression，OLR）分析模型进行拟合。

2.4.2回归模型选择及偏移评估 EP09-A3指南提供了5种回归模型，如果两种方法测定结果间差值变化表现为恒定SD，则采用OLR回归和恒定SD的Deming回归。如果两种方法测定结果间差值变化表现为恒定CV，则采用加权的最小二乘法（weighted least squares，WLS）回归、恒定CV的Deming回归及Passing-Bablok回归。根据本试验CE法和IE-HPLC法测定HbA1c结果的散点图和差异偏差图表现的数值变化特点，各数据点差值变化一致（恒定SD），r2≥0.95，选取OLR作为最佳回归模型进行拟合，回归方程为Y＝-0.060 92+0.993 1X。将0.065、0.098这两个HbA1c医学决定水平值分别代入拟合方程，其在医学决定水平处的偏倚值分别为-0.105 8%和-0.128 5%，均在偏倚的95%CI范围内。见表2。

表2 采用OLR回归模型估算HbA1c医学决定水平点偏倚结果

3 讨论

糖尿病的高发病率已经成为近20年来世界范围内的公共卫生问题。2型糖尿病是最常见的糖尿病，患者数约为糖尿病总患者数的85%～90%［6-7］。糖耐量受损是2型糖尿病发生的预测因子，也是发生大血管病变的危险因素。2型糖尿病在早期阶段通常无症状，并且可能在几年内不被发现。越来越多的证据表明，有一半的2型糖尿病患者不知道自己患病，因此早期诊断并给予治疗可以减少长期并发症的发生［8］。HbA1c能反映患者过去2～3个月的平均血糖水平，是监测糖尿病患者代谢控制程度的重要参数，因此作为评价碳水化合物代谢的独立参数［9-10］。再现性作为糖尿病患者体内数值的长期可比性是绝对必要的。在DCCT和UKPDS发表后，HbA1c被引入作为监测晚期糖尿病并发症潜在发展的风险参数。在这种背景下，准确度成为允许在糖尿病管理中使用HbA1c作为治疗目标的重要因素。2010年，ADA进一步强调了HbA1c在糖尿病诊断中的重要作用，将HbA1c的分析临界值设为0.065［11］。在首次对HbA1c进行定量检测后，人们采用多种方法来测定HbA1c，从简单的手工微柱法到非常精确的自动高压液相色谱法等。由于HbA1c测定方法的改进和标准化的推行，HPLC对全血直接测定HbA1c，其批内和批间CV均＜1%，检测结果精确，不受存在的变异型血红蛋白及其衍生物的影响，因此，美国国家糖化血红蛋白标准化计划（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）、DCCT及IFCC HbA1c标准化工作组选择HPLC法作为测定HbA1c的“金标准”［12］。

近年来，同一临床实验室普遍采用不同仪器和方法对HbA1c进行测定，而有研究表明，采用不同测定原理的方法检测HbA1c所得结果存在一定程度的差异，各种检测方法测定HbA1c结果的可比性及一致性尤其重要［13-14］。由于临床实际工作的需要，本实验室采用IE-HPLC法和CE法检测HbA1c，根据中国合格评定国家认可委员会CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》中要求规定，实验室采用不同检测方法或设备测定同一样品的同一项目时，应验证测定结果在不同方法间的一致性。由于ADAMSTMA1c HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪已在实验室使用了较长时间，每年都参加新疆维吾尔自治区临床检验中心组织的室间质评且成绩优秀，因此以该系统所用IE-HPLC法作为参考方法，而Capillarys 2 FLEX Piercing HbA1c电泳仪所用CE法作为待评方法与其进行结果比对和偏倚评估分析。参考EP09-A3指南和试验方法比对方面的相关文献，根据比对试验所获得两种方法测定的HbA1c结果，绘制了两者结果间的散点图和差异偏差图，未发现有明显的异常值（离群值），进一步检验离群值，确保无离群值的存在［15-17］。通过分析两种方法检测结果间的散点图、差异偏差图、百分比差异偏差图的变化特征，结果表明CE法和IE-HPLC法测定HbA1c的结果间呈现线性变化趋势，两种方法测定结果间差值变化的总体趋势表现为恒定SD。虽然两种方法检测HbA1c的结果存在偏倚，但偏倚在规定的临床可接受范围内，在实验室日常的操作过程中，作为IE-HPLC法备选方法的CE法，其检测HbA1c结果可以向临床发出。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突