Percoll分离法和SDS沉淀法联合MALDI-TOF MS在快速鉴定血流感染病原菌中的应用

刘沫然 郑玉婷 李红柳 肖铟 杜欣 才奇博

作者单位：161000 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院附属第三医院检验科（刘沫然、郑玉婷、李红柳、杜欣、才奇博），肿瘤一科（肖铟）

近年来，由于临床各类侵入性操作的增加以及抗菌药物的不合理应用，会削弱患者机体免疫功能，增加血流感染的发生率［1］。血流感染具有病情发展迅速且危及生命等特点，会引发机体严重损伤，也是导致重症监护病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的重要原因之一，现已引起临床的高度重视与关注［2-3］。传统血培养鉴定具有易操作、结果准确等优点，但耗费时间较长，细菌培养一般需16～24 h［4］。然而对血流感染患者而言，时间就是生命，及早鉴定出病原菌对提高患者存活率具有重要意义。细胞分离液Percoll是一种硅胶颗粒，含有乙烯吡咯烷酮，不能穿透生物膜，因此多用于病毒、细菌和细胞分离［5］。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）沉淀法利用温和的表面活性剂纯化菌体，去除干扰因素，从而提高细菌鉴定率。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS）是一种新型的细菌鉴定技术，不仅可以鉴定纯培养的菌落，还可以直接鉴定培养结果为阳性的体液、尿液、血液标本，与传统血培养方法比较，明显缩短了细菌鉴定时间［6-7］。本研究收集2022年1—11月齐齐哈尔医学院附属第三医院接收的300份血培养报警阳性标本，探讨Percoll分离法和SDS沉淀法联合MALDI-TOF MS在快速鉴定血流感染病原菌中的应用价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1样本收集 收集2022年1—11月齐齐哈尔医学院附属第三医院接收的300份血培养报警阳性标本（报警时间＜48 h），剔除同日同一位患者重复报警的标本。

1.2仪器与试剂 安图AUTOF-MS1000基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪购自郑州安图生物工程股份有限公司，BD 9120全自动血培养仪购自美国BD公司，DL96A全自动微生物鉴定及药敏分析系统购自珠海迪尔生物工程股份有限公司，HF151细菌培养箱由上海力申科学仪器有限公司提供。SDS溶液购自北京中诺泰安科技有限公司，Percoll细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司，中国蓝琼脂平板和血琼脂平板均购自郑州安图生物工程股份有限公司。

1.3研究方法

1.3.1菌种鉴定 将收集的血培养报警阳性标本立即接种到血琼脂平板和中国蓝琼脂平板，在35 ℃需厌氧环境中培养16～24 h后，对单个菌落进行染色镜检，通过MALDI-TOF MS对细菌进行直接鉴定。

1.3.2Percoll分离法 取3 mL 0.9%氯化钠溶液和3 mL培养瓶内容物，加入15 mL离心管中，混匀后以1 000 r/min（离心半径为8 cm）离心10 min，将上清液移至另一支离心管中，以5 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入0.4 mL超纯水，转移至提前加入2 mL Percoll液的离心管中，氯化钠溶液与Percoll溶液的体积比为7︰3，以5 000 r/min离心5 min，弃上清液，转移余下的液体至平底EP管，以13 000 r/min离心2 min，弃上清液，重复洗涤2次，直至洗涤液清亮。

1.3.3SDS沉淀法 取3 mL 0.9%氯化钠溶液和3 mL培养瓶内容物，加入15 mL离心管中，混匀后以1 000 r/min离心10 min，将上清液移至另一支离心管中，加入1 mL 0.05% SDS溶液，将管内溶液颠倒混匀，以5 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1.5 mL超纯水，混匀后转移至平底EP管，以13 000 r/min离心2 min，弃上清液，重复洗涤2次，洗涤后尽可能排干多余水分。

1.3.4MALDI-TOF MS直接鉴定法 取1 μL富集菌体，涂布在金属靶板（96孔）上，在室温环境下干燥处理，加入1 μL 70%甲酸，室温环境下干燥处理，加入1 μL基质液覆盖，室温环境下干燥处理，将靶板置于MALDI-TOF MS质谱仪上，进行细菌鉴定分析，详细记录鉴定结果。

1.3.5传统血培养鉴定法 将采集的阳性标本接种到中国蓝琼脂平板和血琼脂平板上，在需厌氧环境下孵育16～24 h，孵育温度为35 ℃，获得纯菌落后，进行细菌鉴定。

1.4统计学方法 数据处理采用SPSS 26.0 软件，计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Percoll分离法与SDS沉淀法鉴定结果比较300份标本中分离出210株革兰阴性（Gram negative，G-）菌、78株革兰阳性（Gram positive，G+）菌以及12株念珠菌。Percoll分离法对G+菌、G-菌和念珠菌的鉴定率均明显高于SDS沉淀法，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 Percoll分离法与SDS沉淀法对菌株的鉴定结果

2.2MALDI-TOF MS对Percoll分离法和SDS沉淀法处理后标本的病原菌鉴定结果与传统血培养鉴定结果比较 MALDI-TOF MS对Percoll分离法处理后标本G+菌、G-菌的鉴定率均明显高于SDS沉淀法处理后标本病原菌的鉴定率（均P＜0.05），MALDI-TOF MS对Percoll分离法处理后标本真菌鉴定率与传统血培养鉴定率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。MALDI-TOF MS对SDS沉淀法处理后标本G+菌、G-菌的鉴定率均明显低于传统血培养方法（均P＜0.05）。见表2。

表2 MALDI-TOF MS对Percoll分离法和SDS沉淀法处理后标本病原菌鉴定结果与传统血培养鉴定结果比较

3 讨论

血流感染是由于各种毒素和病原菌生物侵入人体血液系统而引发的一种血液感染，脓毒症血流感染是一种较严重的全身感染性疾病，血液中不断释放大量毒素和代谢产物，会加重患者的原发病，增加病死率［8-9］。血流感染具有病情进展迅速、病死率高、预后差等特征，病死率可高达20%以上［10］。快速鉴定血流感染病原菌对患者疾病的早期诊断及治疗具有重要意义。传统血培养是临床诊断血流感染的“金标准”，但该方法耗费时间较长，尤其是对于非典型微生物、苛氧菌等，诊断时间更长，不能满足临床诊治需求［11-12］。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、病原菌核酸技术荧光原位杂交虽然也能明确病原菌类型，但菌种受限于已知类型，具有对检测人员技术要求高、耗时长、成本高等不足［13］。MALDI-TOF MS技术给血流感染的病原菌类型鉴定提供了廉价、高效、可靠的方法。

由于MALDI-TOF MS检测法对蛋白的纯度及丰度要求较高，因此在进行MALDI-TOF MS法检测前需要先分离培养物中的菌体，将血浆蛋白和细胞去除，最大限度降低对检测结果的干扰［14-15］。本研究对选定的血液样品在MALDI-TOF MS检测前先通过Percoll分离法和SDS沉淀法快速提取血培养阳性病原菌，结果显示，Percoll分离法对G+菌、G-菌、念珠菌的鉴定率均明显高于SDS沉淀法，差异均有统计学意义，表明Percoll分离法对提取血培养阳性病原菌的鉴定率高于SDS沉淀法。本研究结果显示，MALDI-TOF MS对Percoll分离法处理后标本的病原菌鉴定率明显高于SDS沉淀法处理后标本病原菌鉴定率，表明将MALDI-TOF MS法与Percoll分离法结合可提高对病原菌的鉴定率，鉴定结果与传统血培养鉴定结果较接近。分析原因可能是SDS沉淀法在提取和鉴定病原菌的过程中，虽然使用的SDS溶液浓度较低，但仍会影响脆弱拟杆菌等部分G-菌的形态结构，导致SDS沉淀法检测的部分G-菌发生黏液化，从而导致病原菌聚集成团，最终降低鉴定诊断的准确度［16-17］。SDS沉淀法处理后病原菌的鉴定率降低，考虑可能与部分细菌的细胞壁结构不同有关，G-菌与G+菌比较细胞壁更薄，含有大量蛋白质及脂类物质，因此，洗涤过程中更易被SDS溶液破坏。虽然与SDS沉淀法比较，Percoll分离法提高了鉴定率，但该方法也存在一定不足，如增加了洗涤过程的复杂性，在洗涤过程中容易丢失部分菌体［5］。MALDI-TOF MS检测法步骤更简便，结果更精确，对经Percoll分离法处理的标本进行鉴定时，可更加直接、快速、准确地鉴定病原菌类型，提高鉴定结果与传统血培养鉴定结果的符合率，为血流感染患者的早期诊断与治疗提供了科学的参考依据，具有较强的实用性［18-19］。梁林等［20］研究表明，Percoll分离法结合MALDI-TOF MS对G-菌的鉴定率（84.5%）明显高于SDS沉淀法结合MALDI-TOF MS（60.6%），与本研究结果接近，验证了Percoll分离法结合MALDI-TOF MS在血流感染病原菌的快速鉴定中鉴定率更高。

综上所述，将Percoll分离法结合MALDI-TOF MS应用于血流感染病原菌的快速鉴定中，可提高鉴定率，鉴定结果与传统血培养鉴定结果接近，符合率较高，因此临床实用价值较高，值得推广、参考、借鉴，给更多血流感染患者的早期诊治带来福音。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突