广西梧州地中海贫血流行现状及罕见基因型研究

余永雄，陈唯，陈洁，梁栋，黄小娟，廖彭

(广西壮族自治区梧州市妇幼保健院检验科，广西梧州 543002)

地中海贫血(thalassemia，简称“地贫”)是源于珠蛋白基因突变而引起珠蛋白合成障碍，导致溶血性贫血的一类常染色体隐性遗传血液病。地贫的分子基础复杂、突变类型多，地贫数据库(Http://globin.bx.psu.edu/)资料显示，目前已报道1 600多种珠蛋白基因突变[1]。在临床工作中发现，有些地贫表型筛查阳性的个体，常规试剂盒未检出常见地贫基因，须进一步采用相应的技术方法检测其他基因突变，以确定其基因型而防止漏检。本研究通过对广西梧州地区地贫流行现状、罕见基因型类型及表型特征的调查研究，了解本地区地贫基因的突变谱，为建立适用可靠的地贫分子筛查和基因诊断方法、有效实现地贫的人群防控提供科学的理论根据。

1 材料与方法

1.1研究对象 2019年1月至2020年12月于梧州市妇幼保健院及梧州地区三县一市各婚育服务中心接受婚前及产前地贫筛查的夫妇共31 008例，年龄20～42岁，签署知情同意书后，采集各研究对象外周静脉血各2份，EDTA-K2抗凝，其中1份4 ℃保存，用于检测红细胞参数和进行血红蛋白电泳，另1份-20 ℃保存，用于后续所需的地贫基因检测。

1.2主要仪器与试剂 XN-1000血液细胞分析仪及配套检测试剂(日本希森美康公司)， VariantTMⅡ血红蛋白分析系统及配套检测试剂(美国Bio-Rad公司)，Capillarys2 Flex Piercing毛细管电泳仪及配套检测试剂(法国Sebia公司)，全自动核酸提取仪及配套基因组DNA提取试剂盒(厦门致善生物公司)，PCR扩增仪(珠海黑马公司)，缺失型α-地贫基因试剂盒(深圳益生堂生物公司)，非缺失型α-地贫基因和β-地贫基因试剂盒(深圳亚能生物公司)等。

1.3血液学表型分析 用XN-1000血液细胞分析仪检测血红蛋白含量(Hb)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)；用VariantTMⅡ血红蛋白分析系统或Capillarys2 Flex Piercing毛细管电泳仪检测Hb组分。根据广西地贫筛查及产前诊断技术规范，以MCV<82 fL和/或MCH<27 pg、HbA2升高或降低、HbF升高、检出异常血红蛋白等为表型筛查阳性判断标准，将初筛阳性样本进行后续的地贫基因检测。

1.4常规地贫基因检测 按全自动核酸提取仪及配套试剂盒说明书，提取基因组DNA，灭菌双蒸水稀释至50～100 ng/μL。按各试剂盒说明书，检测中国人群常见的4种缺失型α-地贫基因(--SEA、-α4.2、-α3.7、--THAI)、3种非缺失型α-地贫基因(αWSα、αQSα、αCSα)和17种β-地贫基因点突变CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)、CD71-72(+A)、CD17(AAG>TAG)、CD26(GAG>AAG)、CD31(-C)、CD27/28(+C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、CD43(GAG>TAG)、-32(C>A)、-29(A>G)、-30(T>C)、CD14-15(+G)、CAP+40-43(-AAAC)、起始密码子Int(ATG>AGG)、IVS-Ⅰ-5(G>C)。

1.5罕见地贫基因及异常血红蛋白基因分析 按表型与基因型相结合的地贫基因诊断原则，对有地贫表型特征或异常血红蛋白组份未检出地贫基因、基因型结果与表型参数不符的样本，送深圳亚能生物技术公司，根据红细胞表型参数及血红蛋白组分等具体情况，采用多重链接探针扩增技术(MLPA)、缺口PCR(Gap-PCR)、基因测序等相应技术对珠蛋白基因进行进一步检测，将检测结果与人类珠蛋白基因数据库(http://globin.bx.psu.edu/)进行比对分析，以确定其基因型。

2 结果

2.1地贫常规基因检测结果 31 008例人群样本中，地贫血液学表型初筛阳性7 853例。经常规试剂盒检测常见地贫基因，并按基因型结果与表型特征相符的原则进行分析，确定了7 632例常见地贫基因型样本，包括α-地贫5 136例、β-地贫2 023例、α-地贫合并β-地贫473例。

2.2罕见地贫基因及异常血红蛋白分析结果 221例表型阳性而未检出常见地贫基因、基因型结果与表型特征不符、血红蛋白电泳分析异常带的样本，经进一步检测分析，共检出异常血红蛋白、少见或罕见地贫基因53例，见表1。

表1 53例罕见地贫基因及异常血红蛋白基因型

2.3广西梧州地区地贫基因突变谱 根据确诊基因型，在7 853例表型筛查阳性样本中，7 685例检出珠蛋白基因突变携带者的分类及比例见表2，人群珠蛋白基因突变携带率为24.78%(7 685/31 008)；共计检出8 019个地贫等位基因，其分类及比例见表3。

表2 广西梧州地区7 685例珠蛋白基因突变携带者分类及其比例

表3 广西梧州地区地中海贫血基因突变谱及其比例

3 讨论

由于地贫基因具有明显的遗传多样性，常规试剂盒只覆盖了中国人群中95%～98%的地贫基因突变，罕见或未知突变的漏检率约为2%[2-3]。夫妇一方为携带者而另一方漏检，即易导致重型地贫患儿的出生。

在本地区的31 008例婚前或产前人群样本中，共检出7 685例珠蛋白基因突变携带者，其中α-地贫携带者占67.08%，β-地贫携带者占32.71%，异常血红蛋白者占0.21%，人群总携带率为24.78%，且SEA缺失或CD41-42(-TCTT)分别为最常见的α-和β-地贫基因，与广西壮族自治区分子流行病学调查所报道的总体数据相符[4]。β-地贫基因突变谱中，-28(A>G)常见，与广西地区分子流行病学调查总数据不同[4]，但与本团队2013年[5-6]及任振敏等[7]的报道结果一致。本研究检出的β-地贫基因纯合子或双重杂合中间型个体占β-地贫携带者的1.23% (31/2 514)，较本团队2013年所报道有明显下降，很可能是全区范围内所实施的地贫人群大防控，降低了β-地贫基因纯合子或双重杂合子胎儿的出生率。

本研究中检出β-地贫合并α-地贫473例，占β-地贫携带者的18.81%(473/2 514)。α-/β-复合型地贫携带者的血液学表型通常为β-地贫(Hb A2增高)表型特征，因此对β-地贫确诊者需要再进行α-地贫基因检测，以免漏检。本结果也说明泰国型α0-地贫基因缺失(--THAI)在本地区具有较高的频率，有必要在临床实践中应用包含此突变类型的商品化常规试剂盒，以防漏诊误诊。

从基因型结果与表型特征不符而进一步检测分析的221例样本中：(1)检出8例香港型(HKαα/αα)。HKαα是α珠蛋白基因簇同源序列不等交换所致，HKαα/αα患者临床表现为静止型地贫[8]。常规α-地贫基因缺失型gap-PCR检测时疑为-α3.7，却与血液学表型、临床特征不相符时，需高度怀疑HKαα/αα并进一步确认。另外，基因型为HKαα/--SEA的症状要轻于--SEA/-α3.7的HbH病，临床表型类似--SEA/αα，因此应避免在产前诊断中将HKαα/--SEA误诊为-α3.7/--SEA。(2)检出罕见β-地贫基因CD37(TGG>TAG)突变5例、-90(C>T)4例，提示这2个突变在本地区人群有一定的携带率，有必要纳入常规检测的位点范围以防漏检[9-10]。(3)检出中国型Gγ+(Aγδβ)0缺失5例，此突变的携带者个体表型为典型的遗传性高胎儿血红蛋白血症(HPFH)，因此当血红蛋白电泳分析HbA2稍低或正常，HbF明显增高(约为10%～20%)[11]，则首先检测是否为此突变基因携带者。(4)检出异常血红蛋白基因突变16例，其表型特征均表现为血红蛋白电泳分析时检出异常带，其中最常见的为Hb New York。必须注意的是，Hb New York于血红蛋白高效液相色谱分析难以检出，而毛细管电泳在Z11区可见电泳条带[12]。(5)另168例表型特征为MCV或MCH偏低的样本，部分检出无生物学效应的同义突变或非编码区单碱基多态，未发现明确意义的珠蛋白基因突变而排除地中海贫血或异常血红蛋白病，其血液学表型可能源于其他因素，如缺铁、G6PD缺乏等。

本研究充分说明在地贫基因分子诊断中，必须严格遵循血液学表型与基因型相结合的原则，采用可靠的操作流程和检测技术，保证地贫基因的检出率及准确性，避免漏诊或误诊。