活度积比和EQUIL2法评估中国肾结石患者常见钙盐成分尿液相对过饱和水平的一致性分析

周悦玲，李允武，朱秋毓，丁峰，王文姬

(上海交通大学医学院附属第九人民医院 a.肾脏内科，b.药剂科，上海200011)

肾结石是泌尿系统常见病、多发病，大量研究显示该疾病患病率近年来呈上升趋势，复发率亦较高[1]。尿液中存在多种与肾结石形成相关的代谢物质，如钙、草酸、枸橼酸等，这些影响肾结石形成的促进因子与抑制因子在不同浓度和酸碱度下相互作用，决定着肾结石的发生及肾结石成分的多样性，其中草酸钙(calcium oxalate，CaOx)和磷酸钙(calcium phosphate，CaP)是最常见的肾结石类型，磷酸钙结石又主要分为透钙磷石(brushite，Bru)和羟磷灰石(hydroxyapatite，HAP)[2]。肾结石的代谢评估是诊治的重要环节，24 h尿液成分分析为评估患者代谢特征提供了较为全面的信息，多项国际指南均推荐将24 h尿液成分分析作为肾结石代谢评估的首要检查[3-5]。研究人员利用化学热力学和动力学模型对24 h尿液各项成分行进一步分析，建立了一系列方法对常见肾结石成分在尿液中的相对过饱和水平进行定量评估，该指标可直接反映尿液中各种晶体的形成风险，对肾结石患者的诊断及治疗具有重要的临床价值。

评估尿液相对过饱和水平的常用方法主要包括活度积比(activity product ratio)公式及EQUIL2、JESS(Joint Expert Speciation System)和Lithorisk等软件方法[6-10]，其中活度积比和EQUIL2 2种方法因其经济、便捷等特点在国外应用较广。上述方法均基于国外人群背景建立，由于我国人群相较存在较大遗传和代谢差异，且我国目前对肾结石患者尿液相对过饱和水平的研究较少，故上述方法在我国人群中应用的一致性有待验证。此外，不同评估方法所得结果存在数值差异，无法直接进行比较，不利于临床随访监测，因此建立常用方法结果间函数关系的回归模型十分必要。本研究通过对本中心99例肾结石患者的相关资料进行回顾性分析，采用活度积比和EQUIL2法计算草酸钙和磷酸钙等常见成分在尿液中的相对过饱和水平，对上述方法所得结果的相关性和一致性进行验证，为2种方法结果间的转换提供参考依据，对评价肾结石患者尿液中含钙晶体的形成风险具有一定应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2015年9月至2020年9月于上海交通大学医学院附属第九人民医院就诊的肾结石患者99例。纳入标准：①临床明确诊断为肾结石患者；②年龄≥18岁；③有完善的24 h尿液成分分析结果且同一项目检验方法一致；④既往无肾结石药物治疗史。排除标准：①24 h尿液分析前3个月内有明确泌尿系梗阻、泌尿系感染、急性肾损伤、泌尿系结石手术史；②存在消化道出血、腹泻、恶性肿瘤等急慢性疾病。本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院医学伦理委员会审查批准(伦理批件号：SH9H-2020-MT12-1)。

1.2资料收集

1.2.1一般资料收集 回顾性收集患者一般人口学信息和既往病史，包括性别、年龄、出生日期、泌尿系结石相关病史，所有入选患者均无肾脏病史及泌尿系结石家族史。

1.2.2实验室资料收集 回顾性收集患者24 h尿液成分分析资料，包括24 h尿液量、pH及尿液尿素、肌酐、尿酸、钠、钾、氯、钙、磷、镁、草酸、枸橼酸等。

1.3主要仪器及试剂 DxC800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器公司)，e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，离子排阻色谱柱(RezexTM ROA-Organic Acid，250 mm×4.6 mm，美国Phenomenex公司)。

肌酐试剂盒(酶法)、尿素试剂盒(酶法)、尿酸试剂盒(酶法)及钠、钾、氯、钙、磷、镁试剂盒(间接离子选择电极法)均购自美国贝克曼库尔特公司，草酸、枸橼酸试剂盒(高效液相色谱法)购自美国Waters公司。以上各项检测项目均采用相应配套校准品进行校准，所有样本检测室内质控均在控，所有检测项目在上海市临床检验中心定期室间质评中表现良好。

1.4标本采集与处理 为患者提供统一的尿液收集桶(刻度精确至1 mL)，告知24 h尿液标本留取方法，于早晨7时起床排空膀胱后开始收集之后24 h内的全部尿液标本，所有尿液不添加防腐剂。计量24 h尿液总量，标本混匀后取10 mL用于pH测定，另取10 mL进行分装，-80 ℃冻存，标明患者编号、采集时间和尿液量，以备后续生化检测。

1.5尿液标本检测 新鲜的24 h尿液标本混匀后取10 mL，即刻采用PHS-3C型pH计测定尿液pH。其余检测项目在检测前先将尿液冻存标本恢复至室温，2 500×g离心10 min后采用DxC800全自动生化分析仪和高效液相色谱仪测定尿液肌酐、尿素、尿酸、钠、钾、氯、钙、磷、镁、草酸、枸橼酸等项目。测定尿液尿酸前需对样本进行氢氧化钠碱化处理，测定尿液草酸、枸橼酸前需对样本进行盐酸酸化处理。

1.6尿液草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平计算 应用活度积比公式计算24 h尿液中草酸钙活度积比[AP(CaOx) index EQ]、磷酸钙活度积比[AP(CaP) index]、透钙磷石活度积比[AP(Bru) index]和羟磷灰石活度积比[-lgAP(HAP) index][6-7]。用EQUIL2软件计算24 h尿液中草酸钙、透钙磷石、羟磷灰石的相对过饱和水平(supersaturation，SS)和晶体自由能变化(delta Gibbs free energy，DG)[8]。本中心暂未建立尿硫酸盐水平检测方法，既往研究支持在无尿硫酸盐结果的情况时可使用固定数值替代，结合多项研究的尿硫酸盐参考区间及JESS软件尿硫酸盐默认值，确定以24 h尿硫酸盐排泄量12 mmol/24 h计算尿硫酸盐浓度代入EQUIL2软件进行计算[11-14]。活度积比与EQUIL2方法关于尿液相对过饱和水平的评价指标及计算方法见表1。

表1 活度积比与EQUIL2方法关于尿液相对过饱和水平的评价指标及计算方法

2 结果

2.1研究对象临床资料特征 本研究共纳入99例肾结石患者，其中男性53例，女性46例。患者年龄分布如下：30岁以下14例，30～39岁10例，40～49岁16例，50～59岁28例，60～69岁21例，70岁及以上10例。48例(48.5%)患者24 h尿量低于泌尿系结石国际指南所推荐的2 500 mL/24 h[3-5]，24例(24.2%)患者尿钠高于正常上限，29例(29.3%)患者存在高钙尿症，9例(9.1%)患者存在高尿酸尿症，47例(47.5%)患者存在高草酸尿症，14例(14.1%)患者存在低枸橼酸尿症。进一步对尿液中草酸钙和磷酸钙的相对过饱和水平分析发现，93例(93.9%)患者SSCaOx>1(或DGCaOx>0)，呈现出草酸钙相对过饱和情况，其中10例(10.1%)患者AP(CaOx) index EQ>2.0(或DGCaOx>2.8)，提示草酸钙晶体更易析出[15]；44例(44.4%)患者SSBru>1(或DGBru>0)，96例(97.0%)患者SSHAP>1(或DGHAP>0)，呈现出磷酸钙相对过饱和情况。99例肾结石患者24 h尿液分析结果见表2。

2.2活度积比和EQUIL2相关指标间的关系 草酸钙和磷酸钙在尿液中的相对过饱和水平可直接反映尿液中草酸钙和磷酸钙晶体的形成风险。对活度积比和EQUIL2所得指标进行相关性分析发现，SSCaOx与AP(CaOx) index EQ的Spearman相关系数r为0.930(95%CI：0.896～0.953，P<0.001)，SSBru与AP(Bru) index的Spearman相关系数r为0.979(95%CI：0.969～0.986，P<0.001)，DGHAP与-lgAP(HAP) index的Pearson相关系数r为-0.968(95%CI：-0.979～-0.952，P<0.001)，提示2种方法在评估尿液中草酸钙、透钙磷石和羟磷灰石相对过饱和水平上均具有较强的相关性。进一步对各组指标进行线性回归分析，以明确活度积比和EQUIL2法所得结果间的函数关系。结果显示，SSCaOx与AP(CaOx) index EQ、SSBru与AP(Bru) index、DGHAP与-lgAP(HAP) index呈线性关系。在草酸钙和羟磷灰石相对过饱和水平方面回归模型拟合程度较高，而在透钙磷石相对过饱和水平方面回归模型拟合程度一般(表3，图1)。

表3 活度积比和EQUIL2评估尿液中草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平相关指标线性回归模型

注：A，草酸钙SSCaOx与AP(CaOx)index EQ线性回归曲线；B，透钙磷石SSBru与AP(Bru)index线性回归曲线；C，羟磷灰石DGHAP与-lgAP(HAP) index线性回归曲线。

2.3活度积比和EQUIL2法评估尿液中草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平的一致性检验 对活度积比和EQUIL2评估尿液中草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平进行Bland-Altman一致性检验。以2种方法测得值的均数为横坐标，以2种方法测得值的差值为纵坐标，绘制散点图，并以差值的均数±1.96倍标准差作出95%一致性界限(limits of agreement，LoA)。如图2所示，SSCaOx与AP(CaOx) index EQ差值的95% LoA为-2.08～10.12；SSBru与AP(Bru) index差值的95% LoA为-8.27～4.20；DGHAP与-lgAP(HAP) index差值的95% LoA为-60.93～-35.94。Bland-Altman图直观显示了2种方法所得结果的差值均主要分布于95% LoA内，提示活度积比和EQUIL2在评估尿液草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平上均具有较高的一致性。与此同时，也发现2种方法所得结果的差值随均值成一定比例变化趋势，提示2种方法所得数值存在一定差异，可根据回归模型转换后进行比较。

注：A，草酸钙SSCaOx与AP(CaOx)index EQ指标一致性检验；B，透钙磷石SSBru与AP(Bru)index指标一致性检验；C，羟磷灰石DGHAP与-lgAP(HAP) index指标一致性检验。

3 讨论

肾结石的形成与尿液中多种因子的水平密切相关，各因子对晶体形成的影响不尽相同，因此根据各因子水平变化来预测肾结石形成风险较为困难。研究人员为解决这一难题提出了相对过饱和水平的概念，多项研究显示草酸钙、磷酸钙、尿酸等肾结石常见成分在尿液中的相对过饱和水平与肾结石发生风险存在相关性，可用于预测肾结石的形成风险。Prochaska等[16]基于NHS Ⅰ、NHS Ⅱ、HPFS 3个大规模前瞻性研究队列，开展了一项有关24 h尿液相对过饱和水平与肾结石形成风险间关系的横断面研究，各选取了数百名肾结石患者及非肾结石对照者的24 h尿液分析资料研究发现，尿液中草酸钙和磷酸钙的相对过饱和水平越高者患肾结石可能性越大，而尿酸相对过饱和水平越高的女性患肾结石的风险增高。Ferraro等[17]针对合并特发性高钙尿症的复发性肾结石患者研究发现，饮食干预1周后尿液草酸钙相对过饱和水平的下降与肾结石复发风险降低相关。

活度积比、EQUIL2、JESS、Lithorisk等方法是目前用于评估常见肾结石成分的尿液相对过饱和水平的重要工具[6-10]，活度积比是基于实验方法得出的计算公式，其他3种方法则是基于化学热力学和动力学模型建立的计算机模拟软件，由于JESS和Lithorisk是付费软件，应用范围不及前两者广泛。上述分析方法均可用于评估草酸钙和磷酸钙在尿液中的相对过饱和水平，以预测尿液中草酸钙和磷酸钙晶体的形成风险。Tiselius等[6-7]利用各5项尿液指标建立了草酸钙活度积比AP(CaOx) index和磷酸钙活度积比AP(CaP) index计算公式，由于常见的磷酸钙晶体包括透钙磷石和羟磷灰石，故进一步推导出AP(Bru) index和-lgAP(HAP) index计算公式。EQUIL2通过对24 h尿液指标进行计算机模拟分析，得出尿液中草酸钙、透钙磷石、羟磷灰石、无水尿酸盐、尿酸钠的相对过饱和水平和晶体自由能变化，当某晶体成分SS>1或DG>0提示该成分呈过饱和状态易于析出，反之则提示呈溶解状态[8]。既往研究显示，当AP(CaOx) index EQ>2.0或DGCaOx>2.8时，24 h尿液中可出现草酸钙晶体析出[15]，而有关磷酸钙晶体的研究数据尚不明确。

目前针对不同方法评估肾结石常见成分在尿液中相对过饱和水平的一致性研究仍较少，各方法所得结果暂无法直接进行比较，同时针对我国人口的研究数据较为缺乏，本研究可作为一定补充，为实现不同方法结果间的转换提供了一定理论依据。本研究通过对99例肾结石患者的24 h尿液分析发现，绝大多数患者存在草酸钙相对过饱和情况，磷酸钙中的羟磷灰石较透钙磷石表现出更大比例的相对过饱和情况。活度积比和EQUIL2 2种方法在评估尿液草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平上均通过了Bland-Altman一致性检验。相关和回归分析则显示了2种方法所得结果之间的函数关系，在草酸钙和羟磷灰石的评估方面回归模型拟合程度较高，而在透钙磷石方面回归模型拟合程度一般。Pak等[18-19]以实验性方法测定活度积比作为基本对照，对JESS和EQUIL2 2种计算机软件进行比较发现，JESS由于综合考虑了多项可溶性化合物对晶体相对过饱和水平的影响，在评估草酸钙相对过饱和水平方面优于EQUIL2；此外，EQUIL2在评估透钙磷石相对过饱和水平方面存在约80%的高估情况，JESS则相对更加准确，但在尿pH和尿钙水平过高或过低时可能存在一定偏倚。Rodriguez等[20]对211例肾结石患者研究发现，4种方法在评估草酸钙相对过饱和水平上具有高度相关性；在评估磷酸钙相对过饱和水平方面除了AP(CaP) index相关性稍差以外，其他3种方法均具有高度相关性；在评估尿酸盐相对过饱和水平上，3种计算机软件均表现出良好的相关性。此外，研究人员还对现有预测方法不断进行优化和创新。建立了JESS方法的学者提出，肾单位中液体所含有的各种物质的过饱和水平或许较尿液更能反映肾结石的形成风险，但前者无法直接测定，因此研究人员利用计算机模拟生理过程，对血液和尿液成分进行综合分析，计算出肾单位中液体的物质水平，以预测成核和晶体形成风险[21]。

本研究也存在一定局限性。首先，研究对象来自单中心，且样本量较小，可能无法反映我国肾结石患者整体情况，研究结果或许也不适用于其他国家或地区。其次，本研究未纳入非肾结石人群，未对上述方法在评估非肾结石人群尿液晶体形成风险的适用性进行分析。第三，本研究仅针对活度积比和EQUIL2 2种方法进行分析，未对JESS、Lithorisk等其他方法在评估草酸钙和磷酸钙相对过饱和水平的应用进行比较，后续研究中应更全面探索适合我国人口特点的评估方法。此外，由于24 h尿液标本留取存在一定不便，致使在临床实践中存在患者配合意愿较低、留取不准确等情况，不利于对肾结石患者及高风险人群的监测和管理，因此需要积极探索可用于替代24 h尿液进行分析的方法。一项针对我国无肾结石群体开展的研究发现，尿液中草酸钙的相对过饱和水平在上午6～10时达到高峰，8～12时的尿液可替代24 h尿液用于评估草酸钙相对过饱和水平[22]；Rodriguez等[23]对无肾结石健康者24 h不同时段的尿液分析发现相对过饱和水平在一天中波动较大，其中草酸钙和磷酸钙的相对过饱和水平在夜间达到高峰，而尿酸的相对过饱和水平高峰则出现在清晨；Hinck等[24]发现肾结石患者夜间12 h尿液中草酸钙、磷酸钙、尿酸的相对过饱和水平与24 h尿液指标相关性较强。目前关于选取何时段尿液标本替代24 h尿液用来预测肾结石形成风险还有待更多研究证据。

本研究显示活度积比和EQUIL2法在评估我国肾结石患者尿液草酸钙和磷酸钙等常见钙盐成分相对过饱和水平上具有较高的一致性，可用于评价肾结石患者尿液中含钙晶体的形成风险。同时，本研究还初步探索了活度积比和EQUIL2法关于评价草酸钙以及常见磷酸钙成分(透钙磷石、羟磷灰石)尿液相对过饱和水平相关指标间的函数关系，可作为不同方法结果间比较的参考，对于肾结石患者的临床诊疗和随访管理具有一定应用价值。