犬蠕形螨混合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的病原鉴定与诊治

夏伦斌孙 立何燕飞孙桃桃

曹建文1,贾 哲1,徐光沛1

(1.皖西学院 生物与制药工程学院,安徽六安 237012;2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室,安徽 六安 237012)

蠕形螨(Follicle mite)寄生于人和哺乳动物的毛囊和皮脂腺内,已知有140 余种和亚种[1]。犬蠕形螨病是由犬蠕形螨(Demodexcanis)引起犬的一种常见而又顽固性的皮肤寄生虫病,又称犬毛囊虫病或犬脂螨病[2]。临床上感染蠕形螨患犬,若不能得到及时治疗或治疗效果不佳,常会导致继发细菌及/或真菌等其他病菌感染,严重影响犬只的健康[3-4]。因此,临床上及时对患犬确诊,是有效治疗的关键。研究表明,犬蠕形螨主要通过直接或间接接触患犬及其周围环境等途径感染,初期以鼻部、眼睛、头等周围少毛或无毛部位为主,然后蔓延至颈部、四肢、腹部、背部[5],由于免疫力下降常引起全身性蠕形螨感染[6],其临床症状多以脱毛、皮炎、瘙痒、红斑、结痂以及伴有腥臭味为特征[3,7]。近年来,犬蠕形螨与细菌及/或真菌混合感染在犬皮肤病临床上比较常见,约占15%～20%,患犬病程较长,治疗周期长,治疗效果不理想,而且特别容易复发[8],给临床治疗造成了困难。本研究通过对1 例疑似犬蠕形螨感染犬,采取隔离,临床症状检查,并结合血常规、生化指标、寄生虫学和微生物学检查等实验室方法,确诊引起患犬的病因,选择适合药物进行对因和对症治疗,观察治疗效果,为犬蠕形螨混合细菌感染的诊断和有效治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患犬来源 患犬为皖西学院小动物诊疗实验实训中心收留的校园流浪犬,杂交犬,约3岁,雌性,体质量约14.3 kg。

1.1.2 试剂药品 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA),购自杭州滨和微生物试剂有限公司;BHI培养基,购自杭州百思生物技术有限公司;革兰氏染液和Diff-Quik 染液,购自上海信帆生物科技有限公司;革兰氏阳性和阴性菌生化检测卡,购自法国梅里埃诊断产品(上海)有限公司;多拉菌素注射液(生产批号1825716),购自美国辉瑞(上海)动物保健品有限公司;盐酸特比萘芬喷剂(生产批号20200401),购自天津保灵动物保健品有限公司;硫酸阿米卡星注射液(兽药字080067009),购自黑龙江省北安市飞龙动物药厂;地塞米松磷酸钠注射液(兽药字120152529),购自合肥中龙神力动物药业有限公司;宠物营养补充剂,购自艾澌克(南京)生物科技有限公司;草本固元膏,购自乾元动物药业有限责任公司;过氧化氢消毒液,购自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

1.1.3 仪器设备 SW-CJ-2FD 型超净工作台,苏州净化设备有限公司;BC-2800VET 型血细胞分析仪,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;DT-480全自动生化分析仪,广州东唐电子科技有限公司;GHP-9270型恒温培养箱,上海齐欣科学仪器有限公司;BK6000生物显微镜,重庆奥特光学仪器有限公司;VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪,梅里埃诊断产品(上海)有限公司;其他仪器和耗材均由皖西学院小动物诊疗实验实训中心提供。

1.2 方法

1.2.1 一般临床检查 对病犬进行体温和全身病变检查并记录。

1.2.2 血常规和血液生化检查 前肢静脉采集血液于抗凝管和EP 管中,分别进行血常规检查和血液生化分析。

1.2.3 寄生虫与真菌检查 先利用伍德氏灯和放大镜进行真菌及体表寄生虫检查,然后进一步依据患病犬的体表病变,采用皮肤深层刮片法,即手持钝刃刀片垂直于皮肤、以中等压力沿毛发生长方向进行刮片,在不同患处采集3张皮肤刮片并镜检;同时用手术刀片刮擦病变部位皮肤并将收集的皮肤渗出物样本涂布到玻片上,干燥后用Diff-Quik染液染色,进行皮肤细胞学检查[9]。观察是否有蠕形螨等寄生虫及真菌性微生物感染。

1.2.4 细菌学检查、病菌分离与鉴定 采用灭菌棉棒于皮肤溃疡处擦拭,蘸取渗出液或脓液,转接到TSA 培养基中,37 ℃过夜培养后观察病菌生长情况。再依据不同菌落形态或颜色挑选单个菌落进行纯化培养,然后转接到BHI培养基培养,离心收集细菌后,用灭菌NaCl溶液(4.5 g/L,p H 6.5)调制菌悬液麦氏比浊度至0.55,然后按照VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪使用说明书进行鉴定。

1.2.5 分离菌药敏试验 在超净工作台内,采用K-B纸片扩散法进行敏感药物筛选[10],用接种环挑取分离菌株单个菌落接种到TSA 培养基平板上,加100μL灭菌蒸馏水,用三角形涂布棒过火焰后,均匀涂布,再分别将8类9种药敏纸片紧贴于培养基表面,然后放置于恒温培养箱培养24 h后,观察并测量记录抑菌圈直径的大小,参考美国国家临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的标准[11]判定药敏试验结果。

1.2.6 确诊与治疗 依据检查结果,分析并确诊患病犬的病因,选择适合药物进行治疗。治疗前推去全身犬毛,用过氧化氢消毒液(30.0 g/L)清洗犬身,吹干后,单独饲喂。采用抗寄生虫和抗菌治疗,同时结合对症和提高犬体免疫力等综合措施进行治疗。

2 结果与分析

2.1 一般临床检查结果

犬体温为38.4 ℃,无异常;体表临床检查可见全身多处大面积脱毛、丘疹性皮炎并伴有红斑和结痂性溃疡(图1-A、B);面部和眼眶周围脱毛、弥散性脱屑、红斑和丘疹性皮炎(图1-C);四肢端及爪部有严重的脱毛、红斑及皮疹(图1-D);此外,患病犬消瘦、喜躲避在角落里,食欲基本正常。

图1 患病犬全身性病变Fig.1 Systemic lesions in sick dog

2.2 血常规检查结果

由表1可知,患犬白细胞数和中性粒细胞数显著升高,红细胞体积分布宽度和血小板数均略有升高,其他指标均在参考值范围,结合一般检查和症状,表明患犬有严重慢性感染和炎症。

表1 治疗前血常规指标检测结果Table 1 Test results of blood routine indicators before treatment

2.3 血液生化检查结果

由表2可知,血液总蛋白含量升高,白蛋白和血钙含量略有降低,γ-谷氨酰基转移酶略有升高,其他各项指标均在参考值范围。血液总蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成,患病犬白蛋白含量略有降低,而总蛋白含量升高,这可能与患犬因全身感染和炎症引起血液免疫球蛋白含量升高有关;白蛋白和血钙含量略有下降,可能因为全身感染导致营养摄入不足引起的。

表2 治疗前血液生化指标检测结果Table 2 Test results of blood biochemical indexes before treatment

2.4 寄生虫与真菌检查结果

经体表检查,未见有疥螨、蜱虫、跳蚤等体表寄生虫,伍德氏灯检查未检出犬小孢子菌感染;进一步皮肤刮片镜检,观察到蠕形螨虫体(图2),同时未检出真菌孢子;皮肤细胞学检查也未见有真菌性致病菌。

图2 皮肤刮片镜检见有蠕形螨虫体(黑色箭头所示,×10)Fig.2 Demodex canis observed by skin scraping microscopy(shown by black arrow,×10)

2.5 细菌学检查、病菌分离与革兰氏染色结果

细菌分离培养获得2种呈不同颜色的菌落,一种呈圆形不透明、边缘整齐光滑的乳白色菌落,另一种为圆形、边缘整齐不透明的金黄色菌落,由此可初步判断为不同的两种细菌株(图3),进一步挑选两种菌株进行纯化培养(图4)。将金黄色菌株和乳白色菌株分别命名为细菌Ⅰ和细菌Ⅱ。革兰氏染色镜检显示细菌Ⅰ为呈不规则葡萄串状排列的革兰氏阳性球菌(图5),细菌Ⅱ为呈单个或双个排列的革兰氏阴性短杆菌(图6)。

图3 皮肤病灶处微生物培养(开放箭头所示为白色菌落,钻石箭头所示为金黄色菌落)Fig.3 Microbial culture result of skin lesions(white colony as shown by open arrow and golden colony as shown by diamond arrow)

图4 2种分离菌纯化培养(左为乳白色菌落,右为金黄色菌落)Fig.4 Purified culture of two isolated bacteria(milky white colony on left and golden yellow colony on right)

图5 细菌Ⅰ革兰氏染色镜检结果(×1000)Fig.5 Gram staining and microscopic examination result of bacteriaⅠ(×1000)

图6 细菌Ⅱ革兰氏染色镜检结果(×1000)Fig.6 Gram staining and microscopic examination result of bacteriaⅡ(×1000)

2.6 分离菌鉴定结果

细菌Ⅰ和细菌Ⅱ分别用革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌生化鉴定卡在VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪上进行鉴定,依据细菌的生化反应结果,结合细菌菌落、染色和形态特点,细菌Ⅰ和细菌Ⅱ分别鉴定为金黄色葡萄球菌(置信度为97%)和大肠杆菌(置信度为99%)。

2.7 药敏试验结果

由图7和表3可知,细菌Ⅰ仅对丁胺卡那霉素敏感,而对万古霉素、头孢氨苄、呋喃唑酮、氨苄西林、氟苯尼考、强力霉素、头孢曲松、环丙沙星等8种药物均耐药;细菌Ⅱ对万古霉素、丁胺卡那和环丙沙星等药物敏感,对头孢氨苄和头孢曲松为中度敏感,对呋喃唑酮、氨苄西林、氟苯尼考、强力霉素等药物耐药。可见,细菌Ⅰ和细菌Ⅱ对丁胺卡那霉素均敏感。

表3 患病犬病灶分离菌株药敏试验结果Table 3 Results of drug sensitivity test for isolated strain from lesions of diseased dog

图7 药敏试验结果(A为细菌Ⅰ;B为细菌Ⅱ)Fig.7 Results of drug sensitive test(A is bacteriaⅠ;B is bacteriaⅡ)

2.8 诊断与治疗效果观察

依据血常规、生理生化指标、寄生虫学和微生物学检查与鉴定结果,结合临床症状,患犬确诊为犬蠕形螨混合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染。

治疗前推去全身毛发,患处用过氧化氢清洗消毒后吹干。采用多拉菌素(10 mg/m L)皮下注射,按0.3 mg/kg体质量给药,每周1次,连续给药6周;用丁胺卡那霉素(50 000 U,50 mg/m L)肌肉注射,按12.5 mg/kg体质量给药,每日2次,早晚各1次,连续给药7 d;地塞米松(0.4 mg/m L)肌肉注射,按2.5 m L/次给药,每日1次,连续给药5 d;草本固元膏(含黄芪、人参叶、枸杞、沙棘等),采用涂抹在犬的鼻端让其舔舐,约10 g/次,每日2次,早晚各1次,连续6周;宠物营养补充剂(含茶多酚、维生素B族等,0.65 g/片),每日5片,碾碎拌料饲喂,连续6周;为了预防继发真菌感染,采用特比萘芬喷剂(1%)喷于患处及其周围,每3 d 1次,连续6周;此外,每周用除螨香波洗浴1次,并用干毛巾擦干。通过以上综合治疗措施,患病犬治疗效果明显,治疗前的全身皮肤症状基本治愈,毛发生长(图8)。经皮肤刮片镜检,未再发现蠕形螨虫体;血常规和生化指标检查未见异常,各项指标均在正常范围。为了巩固治疗效果,一个疗程结束后,休药1周,再连续给药3 d,其中多拉菌素每周1次,连续给药3周。

图8 治疗后患病犬全身病灶恢复情况Fig.8 Recovery of systemic lesions in sick dog after treatment

3 讨论

近年来,随着人们对伴侣动物疫苗接种的认知越来越高,犬瘟、犬细小病毒病等传染性疾病发病率呈下降趋势,但犬的寄生虫性皮肤病,如疥螨病、蠕形螨病等却在犬的临床疾病中所占比例呈现升高的趋势,尤其在高温潮湿季节,占比高达20%～30%[12],严重危害犬的健康,同时也给犬主人带来情感上、生活上和经济上的负面影响。犬蠕形螨病是犬常见的寄生虫性皮肤病之一,以引起犬只脱毛、红斑、色素沉着、继发脓皮病和瘙痒症为主要特征,依据发病程度分为犬局部蠕形螨病和全身蠕形螨病[9]。全身性蠕形螨病为一种较难以治疗的皮肤病,若不能得到有效治疗则很难治愈,甚至危及犬的生命[13]。该病在临床上确诊难度不大,首先依据临床病症是否与犬蠕形螨病病症相符合或相似,可初步疑似蠕形螨感染,进一步通过拔毛法、透明胶带粘贴法或皮肤刮片法制成玻片,进行寄生虫学检查,若观察到蠕形螨虫体或其虫卵即可确诊。本病例患犬临床症状符合全身蠕形螨病的基本特征,经皮肤刮片检查检出蠕形螨虫体,说明有蠕形螨感染。

犬蠕形螨病是一种慢性感染过程,常引起犬的营养不良和免疫力降低,容易造成继发细菌及/或真菌混合感染,在临床诊断上需要特别加以注意,否则容易造成漏诊,导致治疗效果不佳。本病例通过微生物培养,从患犬病灶处分离得到1株革兰氏阳性球菌和1 株革兰氏阴性杆菌,经VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪分别鉴定为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪依据微生物的生化代谢特点,结合现代自动化技术,实现对菌株快速和自动化鉴定,可靠性和重复性极高,非常适合临床快速、准确鉴定病原菌[14-15],相较于微生物传统生化鉴定方法,避免了繁琐、耗时的鉴定过程,同时相较于16S r RNA 基因序列鉴定方法[16],具有成本低、易操作和效率高的特点。因此,本研究中分离菌株鉴定结果可靠,也比较经济。

研究表明,因抗生素的不科学使用,导致犬源细菌呈多重耐药现象比较普遍[17-19]。为了对患犬进行有效治疗,本病例对分离菌进行了药敏试验,分离的金黄色葡萄球菌仅对丁胺卡那霉素敏感,而对其他8种药物均耐药,分离的大肠杆菌对丁胺卡那霉素、万古霉素和环丙沙星等药物敏感,对头孢曲松和头孢氨苄为中度敏感,而对呋喃唑酮等其他4种药物耐药。可见,选择敏感药物在宠物临床感染性疾病治疗上至关重要,起到事半功倍的作用,否则因使用的药物不敏感而导致治疗效果不佳,甚至引起更严重后果。目前,国内宠物医院在进行细菌性感染的治疗过程中,多数情况下没有进行敏感药物筛选或可能因不具备相应实验条件,存在盲目选择抗生素进行治疗现象,这一方面可能导致治疗效果不理想,另一方面也是抗生素的不科学使用,给环境和人类健康带来不利影响,这应该引起临床兽医师的高度重视。

本病例在治疗过程中,采用了抗虫、抗菌、对症和提高犬体免疫力等综合治疗措施。选择多拉菌素进行抗蠕形螨治疗,多拉菌素具有长效、安全和低残留等特点,为目前公认的阿维菌素族中最优的体内外寄生虫药物之一,同时还具有抗炎活性[20];选用丁胺卡那霉素进行抗菌治疗,因分离鉴定的葡萄球菌和大肠杆菌对丁胺卡那霉素均敏感,避免了同时使用多种抗生素;为了进一步改善犬机体炎症反应、以及提升抗毒素、抗过敏等作用,使用地塞米松进行肌肉注射,研究表明,地塞米松联合抗生素进行治疗,能够减轻炎症反应、改善免疫功能[21],但不宜长期使用,因地塞米松是一种肾上腺糖皮质激素,长期使用会引起肾上腺皮质功能不全等毒副作用,因此,本病例治疗中地塞米松给药期为5 d;为了提升患犬的抗病力,还用中药膏剂和维生素等营养补充剂进行补饲,以促进代谢机能,增强机体免疫力;为了预防继发真菌感染,应用特比萘芬抗真菌喷剂进行外用;此外,为了去除犬体表污物保持清洁,每周用除螨香波给患犬洗浴,洗浴后将犬身擦干或吹干,以免潮湿给螨虫提供适宜的生长环境,影响治疗效果。因蠕形螨感染治疗周期较长,治疗不彻底容易复发,为了巩固治疗效果,本病例进行了加强治疗。通过以上措施综合治疗,患犬取得了良好治疗效果,可为犬蠕形螨混合细菌感染的诊断与治疗提供参考。