结肠癌组织中USP22、FoxM1蛋白表达变化及其与患者临床病理特征、预后的关系

张婧，苟园园，张林，刁攀娅

重庆市江津区中心医院，重庆 402260

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，直肠与乙状结肠交界处是其好发部位［1］。结肠癌发病率位于我国癌症发病率第二位［2］，且病死率较高。结肠癌患者平均5年生存率约为50%，而晚期患者5年生存率则低于10%［3］。因此，积极寻找有意义的结肠癌生物学指标，研究其与结肠癌发生发展的关系，对结肠癌患者早发现、早治疗及预后判断有重要意义。去泛素化酶（USP22）是一种泛素特异性蛋白酶，属于去泛素蛋白酶家族［4］，在人体脑、骨骼肌、心脏细胞中均有表达，而在肝脏和肺脏中的表达水平较低。USP22具有多种生物学功能，如调节细胞生长周期、细胞分化及细胞信号转导等［5］。有研究报道，USP22在多种肿瘤（胃癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌等）细胞中也呈高表达状态［6-8］。叉头框蛋白M1（FoxM1）属于Forkhead转录因子家族，该家族蛋白结构内有一个螺旋的DNA结构域。有文献报道，FoxM1在基底细胞癌、肝细胞癌、肺癌及乳腺癌细胞中均呈高表达状态［9］，并且具有调节细胞生长周期、促进肿瘤细胞增殖及分化的作用［10］。本研究探讨结肠癌组织中USP22、FoxM1蛋白表达变化及临床意义，为患者治疗及预后评估提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年3月—2017年12月在本院住院治疗的结肠癌患者198例，男135例，女63例；年龄41～68（55.1±3.9）岁，≥55岁128例，＜55岁70例；肿瘤直径＜5 cm90例，≥5 cm 108例；结肠癌中低分化119例，高分化79例；Duke's分期：A期69例，B期53例，C期48例，D期28例；肿瘤浸润深度：T1～283例，T3～4115例；有淋巴结转移72例。纳入标准：未接受过抗肿瘤治疗；临床资料完整，患者或家属签署知情同意书。排除标准：合并其他系统恶性肿瘤；合并重要脏器疾病；免疫系统功能障碍。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 结肠癌组织及癌旁组织中USP22、FoxM1蛋白表达检测 采用免疫组化法。取结肠癌组织及距离肿瘤边缘大于5 cm的癌旁组织，用甲醛固定后石蜡包埋，使用切片机将组织切成厚度为4μm的切片。切片脱蜡，再经过无水乙醇等梯度水化后PSB缓冲液清洗3次，每次5 min。再将切片放入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0，北京中杉金桥生物技术有限公司）中，100℃加热维持25 min，室温冷却，PSB清洗3次，每次5 min。3%过氧化氢浸泡10 min，去除内源性过氧化氢酶，PSB清洗。分别滴加100μL USP22、FoxM1的一抗（稀释比例1∶100，Abnova公司），4℃过夜，复温30 min后PSB清洗，再滴加100μL二抗，37℃温育30 min，PSB清洗。擦干切片后DAB（DAKO公司）显色5 min，流水冲洗后苏木素复染1 min，流水冲洗后再次乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，晾干。运用Leica DC200图像分析系统收集图像并分析（×400）。随机选取5个视野，每个视野选取100个细胞，根据细胞的染色强度及细胞阳性百分数进行综合评分。染色强度评分：无色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。细胞阳性百分比评分：≤10%计1分，＞10%～50%计2分，＞50%～70%计3分，＞70%计4分，两项评分相乘得0～2为阴性，≥3为阳性［6］。

1.3 随访 从患者出院起，每2～3个月随访1次，包括电话随访或门诊随访两种方式，随访3～36个月，直至2020年12月或患者死亡，收集患者生存数据。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；预后分析采用Kaplan-Meier生存分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织与癌旁组织中USP22、FoxM1蛋白表达比较 结肠癌组织与癌旁组织中USP22蛋白阳性表达率分别为52.5%（104/198）、31.8%（63/198）；结肠癌组织与癌旁组织中FoxM1蛋白阳性表达率分别为59.5%（118/198）、32.3%（64/198）。与癌旁组织比较，结肠癌组织中USP22、FoxM1蛋白阳性表达率高（P均＜0.05）。

2.2 结肠癌组织中USP22、FoxM1蛋白表达阳性与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 结肠癌组织中USP22、FoxM1蛋白表达阳性与患者临床病理特征的关系（例）

2.3 结肠癌组织中USP22、FoxM1蛋白表达与患者预后的关系 198例结肠癌患者均随访成功。3年内，共有60例患者死亡，3年生存率为69.70%。USP22蛋白表达阳性患者3年生存率为60.58%（63/104），阴性患者3年生存率为79.79%（75/94），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。FoxM1蛋白表达阳性患者3年生存率为63.56%（75/118），阴性患者3年生存率为78.75%（63/80），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前结肠癌的治疗方式主要有手术切除及放化疗。虽然医疗技术已经取得重大进步，但是结肠癌患者的发病率和病死率仍不容乐观。我国晚期结肠癌患者的5年生存率仅为8%，早发现、早治疗是提高结肠癌患者预后的有效手段［11］。因此，更深入了解结肠癌的发病机制对于患者治疗及预后有重要意义。

USP22是去泛素蛋白酶家族的新成员，位于人类第17号染色体上，由14个外显子组成，负责编码500多个氨基酸［12］。USP22是SAGA（Spt-Ada-Gcn5-乙酰转移酶）的亚基，可使组蛋白H2A和H2B去泛素化和乙酰化以调节基因的转录和表达［13］。有研究发现，USP22基因是与肿瘤密切相关的11个基因之一，在胃癌及乳腺癌肿瘤细胞中呈高表达状态，并且可以有效预测癌症的治疗效果［14］。USP22在调节细胞生长周期、胚胎发育等过程中发挥着重要的作用。高表达的USP22与结肠癌的预后密切相关［15］。本研究结果发现，结肠癌组织中USP22蛋白阳性表达率远高于癌旁组织。可能因为USP22的去泛素化作用导致抑癌基因p53乙酰化程度降低，进一步抑制了p53介导的细胞凋亡，使得肿瘤细胞增殖速度加快，促进肿瘤细胞的生长［16］。本研究结果还显示，结肠癌组织中的USP22表达与肿瘤Duke's分期、分化程度有关。其原因可能为USP22通过抑制靶基因BMI-1、c-Myc、p53，同时上调p16INK4a、p14ARF的表达来介导肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的恶性进展，使Duke's分期增高［17］。研究结果还显示，结肠癌组织中的USP22表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关，机制可能为USP22上调BMI-1、Cyclin D2的表达，而BMI-1通过调节E-cadherin的表达来促进肿瘤细胞迁移和侵袭［18］。

FoxM1位于人类染色体12p13.3，由10个外显子组成，在全身各个组织具有增殖能力的细胞中均表达。FoxM1具有多种生物学功能，例如调节细胞周期、抑制癌细胞的增殖和迁移等［19］。FoxM1在多种肿瘤细胞中呈高表达状态，如宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌等［12］。近年来有研究发现，FoxM1参与肿瘤细胞的增殖及转移过程，如FoxM1的过表达会导致间充质细胞活化进一步激活胰腺癌细胞上皮—间质转化与癌症干细胞标志物转录过程［20］。本研究结果发现，结肠癌组织中FoxM1蛋白表达上调。机制可能为FoxM1与β-catenin结合并激活了Wnt/β-catenin信号通路，促进癌细胞的增殖，使得肿瘤恶性程度增高［12］。本研究结果还显示，结肠癌组织中的FoxM1蛋白表达与肿瘤Duke's分期和分化程度有关。原因可能是FoxM1通过上调SKP1-Cullin1-F-box泛素连接酶复合物表达来诱导p27、p21的降解，促进肿瘤的恶性进展，使得肿瘤细胞的Duke's分期进一步增高［21］。研究结果还显示，结肠癌组织中的FoxM1表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关，机制可能为下调结肠癌组织中E-cadherin蛋白及其mRNA的表达［22］，促进肿瘤细胞的浸润、迁袭和淋巴结转移，缩短了结肠癌患者生存时间。

本研究中USP22与FoxM1蛋白表达阳性患者的3年生存率均低于阴性患者，表明了两指标均具有促进肿瘤发生发展的作用。USP22可使β-catenin去泛素化，而去泛素化的β-catenin又与FoxM1结合促进肿瘤细胞的增殖、迁袭及转移［12］。

综上所述，结肠癌组织中的USP22与FoxM1的表达均升高，与肿瘤细胞Duke's分期、浸润深度及淋巴结转移相关，这为结肠癌的诊断、治疗及评估预后的过程中提供可靠的依据。但是两指标在结肠癌发展过程中的具体作用机制尚不明确，还需大样本的研究来进一步证实。