猪圆环病毒3型衣壳蛋白抗体间接酶联免疫吸附测定方法的建立与应用

谢晓妍，石玉佩，李潇南，段燕方，张永红，周双海

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，具有多种基因型。猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)是20世纪70年代被发现的，对猪没有致病性[1]。猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是20世纪90年代被发现的，能引起多种猪圆环病毒疾病，给世界养猪业造成较大经济损失[2]。猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)是在2016年被报道发现的，能引起猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并与母猪繁殖障碍和心肌炎等疾病相关[3-5]。由于PCV2的广泛性分布和对养猪业的显著危害性，PCV3被发现后就迅速引起养猪行业人员的关注。目前PCV3已在中国的多个地区被检出，并显示出较高的感染率[6-8]。目前没有PCV3商品疫苗，加强PCV3感染的诊断和流行病学调查具有重要临床意义。

目前，对PCV3感染的检测主要依赖于PCR技术，尚缺乏商品化的PCV3抗体检测试剂盒。与PCV2相同，PCV3也只有一个结构蛋白，也就是衣壳蛋白[3,9]。对于PCV2，衣壳蛋白是诊断抗原的最重要靶蛋白[2]。对于PCV3，已在其衣壳蛋白上发现3个保守的B细胞抗原表位[10]，故其可作为诊断抗原。该研究旨在利用前期原核表达的截短型重组PCV3衣壳蛋白[11]建立一种检测PCV3衣壳蛋白抗体的间接酶联免疫吸附测定方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，以期建立一种检测PCV3抗体和PCV3感染的血清学方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和血清

纯化的截短型重组PCV3衣壳蛋白抗原由北京农学院动物疫病研究室制备[11]；兔抗猪IgG-HRP、四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)显色液、终止液、洗涤液等均为北京索莱宝科技有限公司产品。PCV1、PCV2、PCV3、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)及猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的阳性血清和PCV3阴性血清由北京农学院动物疫病研究室保存。

1.2 间接ELISA的基础操作步骤

取重组PCV3衣壳蛋白抗原包被的酶标板条，在室温下加入血清，37 ℃孵育60 min；弃去液体，用洗涤液洗涤3次，每次1 min，在滤纸上拍干；加入兔抗猪IgG-HRP，37 ℃孵育60 min；用洗涤液洗涤3次，每次1 min，在滤纸上拍干；加入TMB显色液，37 ℃避光反应15 min；加入终止液，15 min内用酶标仪测定OD450 nm值。

1.3 间接ELISA反应条件的筛选

将包被抗原的不同梯度稀释质量浓度(4.880、2.440、1.220、0.610、0.305 μg/mL)和血清的不同梯度稀释度(1∶25、1∶50和1∶100)组成方阵，按照“1.2”间接ELISA的基础操作步骤进行方阵滴定试验筛选和确定最佳的包被抗原质量浓度与血清稀释度。依次对血清孵育时间(0.5、1.0、1.5和2.0 h)、酶标二抗的稀释度(1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000)和孵育时间(0.5、1.0、1.5和2.0 h)、TMB底物反应时间(5、10、15、20和25 min)按照“1.2”间接ELISA的基础操作步骤进行筛选和优化。

1.4 阴阳性临界值的确定

取30份PCV3阴性血清，按已确定的间接ELISA最佳反应条件进行检测，计算其OD450 nm值的平均数(x)和标准差(SD)。当OD450 nm值≥x+3SD时，判为阳性；当OD450 nm值

1.5 特异性试验

用“1.3”已确定的最佳反应条件检测PCV1、PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV阳性血清，同时用PCV3的阳性血清和阴性血清作为对照，检测所建立方法的特异性。

1.6 重复性试验

用同一时间制备的酶标板检测6份血清，每份血清重复检测3次，计算变异系数，评估批内试验的可重复性。用3个不同时间制备的酶标板检测这6份血清，每份血清重复检测3次，计算变异系数，评估批间试验的可重复性。

1.7 临床样品检测及统计分析

用建立的间接ELISA检测方法对2019年来自河北地区的70份、北京地区的248份猪血清样本进行检测，并用卡方检验对两个地区的抗体阳性率进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 间接ELISA反应条件的确定

包被抗原质量浓度和血清稀释倍数的方阵滴定结果见表1。当包被抗原质量浓度为0.610 μg/mL、血清稀释度为1∶25时，P/N值最大、为12.495，故确定间接ELISA的最佳包被抗原质量浓度为0.610 μg/mL、最佳血清稀释度为1∶25。依次确定最佳血清孵育时间为1.0 h，酶标二抗的最佳稀释度为1∶4 000、最佳孵育时间为1.0 h，TMB底物最佳反应时间为15 min。

表1 包被抗原质量浓度和血清稀释度的筛选Tab.1 Screening of the coating antigen concentration and serum dilution ratio

2.2 阴阳临界值的确定

按照确定的最佳反应条件，检测30份PCV3阴性血清，计算得出平均数¯x= 0.122，标准差SD=0.029。故确定，当待测血清样品OD450 nm值≥0.209时，判为阳性；当OD450 nm值<0.180时，判为阴性；而当0.180≤OD450 nm值<0.209时，判为可疑。

2.3 特异性试验结果

用建立的检测方法检测PCV1、PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV阳性血清，并设立PCV3阳性血清和阴性血清对照，结果(表2)显示只有PCV3阳性血清的检测结果为阳性，说明建立的检测方法具有良好的特异性。

表2 特异性试验数据Tab.2 Data of specificity test

2.4 重复性试验结果

批内重复性试验结果见表3，变异系数介于0.78%～3.57%之间，都小于5%，表明批内重复性良好。批间重复性试验结果见表3，变异系数介于0.60%～4.32%之间，都小于5%，表明批间重复性良好。

表3 重复性试验数据Tab.3 Data of repeatability test

2.5 临床样品检测结果

用建立的间接ELISA检测方法检测2019年从河北地区、北京地区采集的血清样品，检测出总的PCV3抗体阳性率为32.70%。其中，河北地区的检测阳性率为42.86%(30/70)，北京地区的检测阳性率为29.84%(74/248)，二者之间无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

PCV3是2016年首次发现的一种新的致病性猪圆环病毒[3]，已经在中国一些地区和猪场流行，并呈逐渐上升趋势[12]。目前，中国对于PCV3感染的检测，大多数采用PCR方法检测病毒核酸；但是在大规模检测时，用ELISA等血清学方法检测病毒抗体无疑要更加实用，不过目前中国还没有检测PCV3抗体的商品化试剂盒。

由于衣壳蛋白是猪圆环病毒的唯一结构蛋白，并具有良好的免疫原性，因此，检测猪圆环病毒感染的抗体检测试剂绝大多数都是基于其衣壳蛋白作为诊断抗原而研制的。有研究者比较分别以全病毒和衣壳蛋白为诊断抗原而建立的检测PCV2抗体的两种ELISA，发现用衣壳蛋白作为诊断抗原时更加有效[13]。前期试验已经高效表达出包含有PCV3衣壳蛋白大多数抗原表位的截短的重组衣壳蛋白[10-11]，以之作为抗体检测用的包被抗原，按照间接ELISA操作规程对其各项反应条件进行筛选与优化，建立一种可用于检测PCV3抗体的间接ELISA。这一方法能够有效检测临床血清样品中的PCV3抗体，并且不会与当前普遍存在的其他猪传染病病原的阳性血清发生交叉免疫反应，显示出良好的特异性。这一方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数都小于5%，显示出良好的可重复性。用该方法检测来自2019年北京地区与河北地区的318份血清样本，发现这两个地区PCV3抗体的总体阳性率为32.70%，与之前的PCR检测结果相近[7-8]，表明北京地区与河北地区的猪场存在较多的PCV3感染。PCV3作为一种新近出现的致病性猪圆环病毒，不仅能够试验感染引起PDNS[5]，还被认为与母猪繁殖障碍有关[3]，故存在PDNS和母猪繁殖障碍的地区与猪场，需要注意防范PCV3的传入和感染。

试验建立的PCV3衣壳蛋白抗体间接ELISA具有良好的特异性和可重复性，能够对临床样品进行有效检测，为PCV3感染的诊断及其流行病学调查提供一种技术支撑，也为PCV3 抗体检测间接ELISA试剂盒的商品化建立基础。