白芨内生菌Ilyonectria robusta的化学成分研究

王献，覃晓夏，刘吉开

（中南民族大学 药学院，武汉 430074）

白芨为兰科植物白芨（Bletilla sfriata）的泥土下的块茎，又名白及，具收敛止血、消肿生肌等功效，有保护黏膜、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗溃疡等药理作用［1-2］. 白芨不仅具有很高的药用价值，在日用品上（如化妆品、纺织印染等）也广泛应用［3-4］. 内生真菌对于植物生长具有重要的影响，如促进种子萌发、提高植物在恶劣环境的适应力等［5-7］. 同时部分内生菌也可以产生与宿主植物类似的次生代谢物，是新化合物、新药源的潜在资源［8-9］. 本课题组在研究白芨内生真菌多样性的基础上，选取一株优势白芨内生真菌强壮土赤壳菌Ilyonectria robusta（I.robusta）对其固体发酵的化学成分进行了初步研究.

强壮土赤壳菌I.robusta广泛分布在木本、草本植物的根以及土壤中，属于植物内生真菌或弱寄生真菌［10］.经过固体培养发酵、甲醇提取、乙酸乙酯萃取、反复柱色谱层析、高效液相制备后从该菌发酵提取物中分离得到6 个化合物（图1）.化合物1 和2为两个新的化合物，并通过一维、二维核磁共振、高分辨质谱、红外、紫外以及多种波谱手段来确定其结 构 为butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-Dleucinate（1）、butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-Dphenylalaninate（2）. 通过波谱学数据及理化性质确定其他已知化合分别为 4-hydroxy-17Rmethylincistero（3）、polyporenic acid C（4）、4-（9H-β-Carbolin-1-yl）-4-oxobut-2-enoic acid methyl ester（5）和perlolyrine（6）.对新化合物1和2进行了抑制人体肿瘤细胞MCF-7的活性评估.此文报道了化合物1～6的分离、结构鉴定以及细胞毒活性.

图1 化合物1～6和L-pGlu-Leu的结构Fig.1 The structures of compounds 1-6 and L-pGlu-Leu

1 实验部分

1.1 样品、试剂和仪器

白芨内生真菌强壮土赤壳菌（Ilyonectria robusta）从采于湖北省恩施州的白芨根中分离得到.菌种鉴定：采用ITS 基因序列法扩增ITS 序列，并将扩增产物进行测序，与NCBI 已知序列对比，鉴定为Ilyonectria robusta.

Isolera one 中压制备系统（瑞典Biotage）；1200/1260 高效液相色谱仪（美国Agilent）；500/600 MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker）；HCT/Esquire 质谱仪（德国Bruker）；Spark10M酶标仪（瑞士TECAN）.

薄层层析硅胶板GF254和柱层析硅胶（80～100目以及200～300 目）均购自中国青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20 凝胶（瑞士Amersham biosciences）；液相色谱柱为ZORBAX SB-C18 柱（美国Agilent；分析型：4.6 mm × 150 mm；制备型：9.4 mm × 150 mm；径粒均为5μm）；显色剂为含香草醛的5%硫酸溶液；LB 固体/液体培养基干粉（北京Solarbio Science&Technology）.

1.2 白芨内生真菌Ilyonectria robusta的培养

采用固体发酵方法，大米80 g，加水100 mL，置于300 mL 种子罐中，于121 ℃灭菌锅灭菌120 min，共培养135 瓶，培养条件：恒温24 ℃；静置，暗培养25 d.

1.3 提取和分离

10.8 kg 大米发酵液用甲醇浸泡提取3 次，每次45 min，提取液合并过滤后减压浓缩除去甲醇，乙酸乙酯萃取5次，每次60 min，合并萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯层总浸膏35 g.以1260 g硅胶（80～100目）进行正相柱层析，氯仿-甲醇体系（1∶0，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1）梯度洗脱，经TLC 薄层色谱检测后合并相似组分，用TLC 进行检测，合并相同馏分，划分为Fr.A～Fr.E.

Fr.D组分（5.3 g）经中压色谱（填充RP-18，甲醇/水：20%～100%）粗分得5 个馏分Fr.D1～Fr.D5. 组分Fr.D2（612 mg）经正相硅胶柱层析（200～300 目），以石油醚-乙酸乙酯（12：1，5：1，2：1）为流动相进行洗脱 后 得3 个 组 分：Fr.D2a～2c. 其 中 组 分Fr.D2b（20.4 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（甲醇）以及制备HPLC（色谱柱SB-C18，5μm，9.4 mm×150 mm，流动相：52%乙腈/酸水）纯化后得到化合物1（3.7 mg）和2（2.8 mg）.组分Fr.D5（403 mg）经Sephadex LH-20（甲醇）分离后得到细分组分Fr.D5b.该组分经过制备型HPLC（流动相，60%乙腈/酸水）纯化后得到化合物3（3.0 mg）. 组分Fr.D3（418 mg）经过正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯（10：1，4：1，0：1）洗脱后得到一结晶粗品，通过洗涤后得到化合物4（10.8 mg）. 组分Fr.D3（362 mg）经过反相硅胶柱层析（甲醇/水1：1）得到细分组分Fr.D3a～3d，其中Fr.D3c（49 mg）再经过制备型HPLC（流动相，43%乙腈/水）纯化得化合物5（3.3 mg）和6（2.9 mg）.

1.4 细胞毒活性实验

采用MTT 法在96 孔板中人乳腺癌细胞MCF-7进行细胞毒活性. 化合物1 和2 分别用DMSO 溶解后配成30 mM 的储备液，使用之前稀释到适宜浓度.将人乳腺癌细胞MCF-7 配制成细胞悬液接种于96 孔板上（100μL/孔），实验分为阳性对照组和5 个给药组，接种好的细胞培养板放入培养箱中培养24 h 后分别加入0.064、0.32、1.6、8 和40μM 的含药样品溶液各10μL，在5%CO2，37 ℃孵育72 h 后，每孔 加 入10μL 配 制 好 的MTT 溶 液（5 mg/mL，即0.5%MTT）继续培养4 h，孵育后使用酶标仪测量在波长为490 nm 下的吸光度（A），并计算IC50值.顺铂（cisplatin）为阳性对照.

2 实验结果

2.1 化合物1结构解析及波谱数据

化合物1 为棕色固体. 根据其高分辨质谱（HRESIMS）数据m/z 299.19659［M+H］+（计算值为299.18926）推测其分子式为C15H25N2O4，不饱和度为4.在1H NMR（表1）图谱中，可以明显观察到3 个靠近的甲基信号峰（δH0.93，0.95，0.98）. 另3 个信号δH4.13（m，2H），4.24（dd，J=8.8，4.3 Hz，1H），4.44（dd，J=8.7，6.4 Hz，1H）表明该碳原子可能连接有杂原子.13C NMR数据（表1）显示该化合物有15个碳信号，结合DEPT 和HSQC 谱图可以确定为3 个甲基、6 个亚甲基、3 个次甲基和3 个季碳信号（表1）.以上数据显示化合物1 同已知化合物L-pGlu-L-Leu（图1）非常相似. 与已知化合物L-pGlu-L-Leu 的核磁数据对照发现［11］，化合物1为该已知化合物C-9位羧基与正丁醇基酯化而来.在HMBC 图谱中，δH4.13（m，2H）与C-9，C-2′，C-3′有相关（图2），δH1.62（m）也与C-9 有相关，并且δH1.40（m，2H）与C-2′，C-3′有相关，证明了该正丁醇基是链接在C-9 位的羧基.进一步对化合物1的1D和2D NMR图谱分析并确定化合物1结构中的其他结片段和已知化合物L-pGlu-L-Leu一致，最终化合物1的结构确定，并命名为butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-D-leucinate.

图2 化合物1和2的主要2D NMR相关示意图Fig.2 The key 2D NMR correlations of compounds 1 and 2

2.2 化合物2结构解析及波谱数据

化合物2 为棕色油状物. 通过HRESIMS 数据（m/z 为355.16269［M + Na］+，计算值为355.17361，C18H24N2O4Na+）确定其分子式为C18H24N2O4，不饱和度为7.通过对比分析化合物2 的1D（表1）和2D NMR数据表明2在结构上与1非常相似.不同的地方在于化合物1的C-11原本链接的两个甲基，而在化合物2中的C-11 链接了一个苯环.首先在1D NMR 谱图中可以观察在化学位移δH7～8之间有5个明显信号峰，表明单取代芳环的存在.进一步分析HMBC图谱，显示δH3.00（dd，J=13.9，9.3 Hz，1H）和3.20（dd，J=13.9，5.8 Hz，1H）与C-8，C-12，C-11和C-9有明显的HMBC 相关（图2），δH7.21（m，1H）以及δH7.22（m，2H）与C-10 也存在HMBC 相关，证明该苯环连接在C-10位.进一步对比碳谱、DEPT谱以及2D核磁相关数据，确定化合物2的其他结构片段和化合物1基本一致，最终化合物2的结构得以确定，并命名为butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-D-phenylalaninate.

表1 化合物1和2的1H NMR和13C NMR数据Tab.1 1H and 13C NMR data of compounds 1 and 2

2.3 已知化合物理化性质及波谱数据

化合物3：分子式C21H32O3，无色油状1H NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.63（d，J= 1.9 Hz，1H），5.25（dd，J=15.3，7.7 Hz，1H），5.16（dd，J=15.3，6.9 Hz，1H），2.64（ddd，J= 11.9，6.8，1.9 Hz，1H），2.28（ddd，J= 14.1，4.1，2.4 Hz，1H），2.05（m，1H），1.98（m，1H），1.91（m，1H），1.87（m，1H），1.85（m，1H），1.73（m，1H），1.65（m，1H），1.63（m，1H），1.60（m，1H），1.51（m，1H），1.48（m，1H），1.04（d，J=6.6 Hz，3H），0.92（d，J= 6.8 Hz，3H），0.84（d，J=6.9 Hz，3H），0.82（d，J=6.8 Hz，3H），0.60（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δC171.1（s），170.7（s），134.8（d），133.0（d），112.4（d），104.9（s），55.5（d），50.5（d），49.0（s），43.0（d），40.3（d），35.4（t），35.2（t），33.2（d），29.0（t），21.（t），21.2（q），20.1（q），19.8（q），17.7（q），11.9（q）.HRESIMS m/z：333［M+H］+.上述数据与文献［12］比对一致，确定化合物3 为降甾醇类化合物4-hydroxy-17R-methylincistero.

化合物4：分子式C31H46O4，白色晶体.1H NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.50（d，J= 6.7 Hz，1H），5.36（d，J=6.3 Hz，1H），4.79（s，1H），4.73（s，1H），4.14（dd，J= 8.5，6.0 Hz，1H），2.77（td，J= 14.6，5.7 Hz，1H），2.50（td，J= 11.1，3.3 Hz，1H），2.35（m，1H），2.29（m，1H），2.26（m，1H），2.24（m，1H），2.22（m，1H），2.20（m，1H），2.14（m，1H），2.10（m，1H），2.05（m，1H），2.00（m，1H），1.89（m，1H），1.83（m，1H），1.76（m，1H），1.72（m，1H），1.54（m，1H），1.50（m，1H），1.17（s，3H），1.12（3H，s，H-29），1.10（s，3H），1.09（s，3H），1.04（overlapped，3H），1.01（overlapped，3H），0.64（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δC216.8（s），179.9（s），155.1（s），144.4（s），141.9（s），120.9（d），116.8（d），107.3（t），77.4（d），57.1（d），50.7（d），48.8（s），47.6（s），46.4（d），44.8（s），43.5（t），37.4（t），36.7（t），35.5（t），34.9（t），33.9（d），32.3（t），30.5（t），26.1（d），25.5（d），23.7（t），22.6（q），22.1（q），22.0（q），21.9（q），17.3（q）. HRESIMS m/z：483［M + H］+. 上述数据与文献［13］数据比对一致，确定化合物4为polyporenic acid C.

化合物5：分子式C16H12N2O3，淡黄色固体.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH8.30（d，J= 5.3 Hz，1H），8.20（d，J= 7.9 Hz，1H），8.03（d，J= 5.2 Hz，1H），7.72（d，J= 8.2 Hz，1H），7.60（ddd，J= 8.2，7.0，1.1 Hz，1H），7.30（t，J= 7.5 Hz，1H），7.23（d，J= 3.4 Hz，1H），6.60（d，J= 3.4 Hz，1H），4.61（s，1H）.13C NMR（125 MHz，methanol-d4）δC157.1（s），154.3（s），143.0（s），138.7（d），134.4（s），132.5（s），132.1（s），130.0（d），122.5（d），122.1（s），121.2（d），114.9（d），113.2（d），111.0（d），110.9（d），57.5（t）.HRESIMS m/z：265［M + H］+. 上述数据与文献［14］数据比对一致，确定化合物5为perlolyrine.

化合物6：分子式C16H12N2O2，黄色固体.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH8.43（s，1H），8.33（d，J=5.0 Hz，1H），8.24（dt，J= 7.9，1.0 Hz，1H），7.72（m，1H），7.61（ddd，J= 8.3，7.1，1.2 H，1H），7.55（d，J=12.1 Hz，1H），7.33（ddd，J=8.0，7.1，1.0 Hz，1H），6.48（d，J= 12.1 Hz，1H），3.64（s，-OCH3）.13C NMR（125 MHz，methanol-d4）δC195.4（s），168.4（s），143.6（s），139.3（d），138.7（d），137.0（d），136.6（s），133.4（s），130.5（d），128.9（d），122.7（d），121.8（d），121.7（s），120.4（d），113.6（d），52.4（t）.HRESIMS m/z：281［M + H］+上述数据与文献［15］数据一致，确定 化 合 物6 为4-（9H-β-Carbolin-1-yl）-4-oxobut-2-enoic acid methyl ester.

2.4 生物活性测试结果

化合物1 和2 对人乳腺癌细胞MCF-7 的体外细胞毒活性（IC50）结果见表2.测试结果显示，化合物1对MCF-7具有一定的抑制作用，IC50为36.2μM.

表2 化合物1和2的肿瘤细胞毒活性（IC50/μM）Tab.2 Cytotoxicity of compounds 1 and 2（IC50/μM）

3 结语

植物内生菌的次级代谢产物在抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性方面展现出较好应用潜力，是新药发现的潜在资源. 本研究从白芨内生真菌Ilyonectria robusta分离纯化得到6 个化合物，其中化合物1 和2为两个新化合物.其他化合物类型包括降甾体、三萜以及吲哚生物碱等，所有化合物均是首次从该菌种中分离得到.