膜联蛋白A7低表达对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

刘明伟，柏友兰，王小杰，李 欣

（承德医学院基础医学院，河北承德 067000）

胃癌是全球第四大恶性肿瘤，每年大约有85万新病例和65万死亡病例[1]。胃癌的发病机制非常复杂，传统的手术和化疗效果都不甚理想，复发率高或毒副作用较大。由于生物治疗因毒副作用小而广受欢迎，因此迫切需要在分子肿瘤学领域研究胃癌的发病机制，从而找到有效的治疗靶点。

膜联蛋白（annexin，ANX）是高度保守的蛋白质，是一种钙依赖性磷脂结合蛋白家族，都具有相似的核心结构域，几乎存在于所有组织和细胞中，主要分布在质膜的内表面，在细胞骨架活性调节、细胞粘附、膜受体调节、膜转运和有丝分裂等方面具有重要作用[2]。膜联蛋白A7（annexinA7，ANXA7）是第一个被发现的膜联蛋白，影响许多生理过程，包括分泌、激素释放、膜转运等[3]。大量研究发现，ANXA7在许多恶性肿瘤中表达失调，在胃癌组织中，ANXA7表达显著增高，并发现，ANXA7 可通过调节细胞周期进程从而调节细胞的增殖和凋亡[4]。本实验通过敲低胃癌MGC-803细胞中ANXA7的表达，观察其对MGC-803细胞增殖和凋亡的影响，为进一步研究胃癌治疗靶点提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人胃癌MGC-803细胞购自中科院上海细胞库；细胞1640培养基购自美国Gibco公司；lipofectamine3000（lipo3000）转染试剂购自美国Invitroden公司；细胞凋亡试剂盒购自联科生物；靶向ANXA7的siRNA购自上海吉玛基因；ANXA7鼠抗人单克隆抗体购自美国Epitomics公司；PCNA鼠抗人单克隆抗体购自武汉三鹰生物；Casepase-3、Cleaved casepase-3及β-actin兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司；羊抗鼠及羊抗兔二抗购自美国KPL公司；MTT购自河北贝博实验用品公司。

1.2 细胞培养及转染

在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养人胃癌MGC-803细胞，转染前一天将对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔3×105个，24h内使细胞汇合度达到40%~60%。将细胞分为2组，以靶向ANXA7的siRNA转染MGC-803细胞为低表达组（ANXA7-si）、以转染阴性siRNA的细胞为阴性对照组（NC）。按照lipo3000转染试剂说明书，将30pmol siRNAOligo和5μl lipo3000分别加入无血清的RPMI 1640培养基中，使终体积均为250μl，静置5min，将两液混匀，静置20min，然后将混合液分别加至对应的孔中。转染后6h更换含血清的培养基。

1.3 Western blot检测转染后ANXA7蛋白的表达

转染后48h，6孔板每孔加入100μl RIPA裂解液，提取总蛋白，BCA试剂盒检测总蛋白浓度，蛋白变性后80V稳压电泳，每泳道30μg样品，电泳后120mA稳流转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，将各膜浸入ANXA7鼠抗人单克隆抗体（1:1000）室温孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，后羊抗鼠二抗（1:2000）室温孵育1.5h，TBST洗膜3次，每次5min，ECL化学发光仪显影。Quantity One软件分析蛋白相对表达量，即目的蛋白与内参蛋白灰度值得比值。

1.4 MTT法检测细胞增殖情况

取对数生长期细胞，以4×103个/孔接种于96孔板，每组5个复孔，各孔加入MTT 10μl（5mg/mL）,37℃孵育4h后弃孔内培养液，每孔再加150μl DMSO震荡10min，酶标仪检测490nm处的OD值，取各组平均值绘制增殖曲线。

1.5 平板克隆实验检测细胞增殖

取对数生长期各组细胞，以1000个/孔接种于6孔板，每孔加入RPMI 1640培养基2ml，培养至出现肉眼可见团落时吸弃培养液，用PBS小心洗两次后加入4%多聚甲醛固定20min，吸弃多聚甲醛，每孔再加入GIMSA 1ml染色10min，流动水小心冲洗后室温干燥，倒置显微镜下计数大于50个细胞的团落，拍照并进行分析。

1.6 PI检测细胞凋亡

将PI（碘化丙啶）溶于含0.1% TritionX-100的PBS中，终浓度为50μg/mL，含RNase 100μg/mL，避光保存；取1ml（1×106）的细胞悬液，加10μl的PI染液混合，作用10min；加入5ml PBS，1500r/min离心5min，弃上清，重复洗涤2次。重悬细胞，滴片并用盖玻片封片,上机检测。

1.7 Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白的表达

转染后48h，6孔板每孔加入100μl RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒检测总蛋白浓度，蛋白变性后80V稳压电泳，每泳道30μg样品，电泳后120mA稳流转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，将各膜浸入PCNA、Cleaved casepase-3单抗（1:1000）室温孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，后加入羊抗鼠二抗（1:2000）和羊抗兔二抗（1:2000）室温孵育1.5h，TBST洗膜3次，每次5min，ECL化学发光仪显影。Quantity One软件分析蛋白相对表达量，即目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Western blot检测ANXA7敲低效率

如图1所示，与阴性对照组（si-con）相比，实验组（si-ANXA7）ANXA7的表达显著降低，效率达到82.33%。

图1 Western blot检测ANXA7的表达

2.2 ANXA7低表达抑制胃癌MGC-803细胞的增殖

如图2所示，MTT和平板克隆法检测结果均显示，与阴性对照组（si-con）相比，实验组（si-ANXA7）的MGC-803细胞增殖受到显著抑制。

图2 ANXA7低表达抑制胃癌细胞增殖

2.3 ANXA7低表达促进胃癌MGC-803细胞的凋亡

与阴性对照组（si-con）相比，实验组（si-ANXA7）的MGC-803细胞凋亡明显增强（图3）。

图3 ANXA7低表达促进胃癌细胞凋亡

2.4 增殖和凋亡相关蛋白的表达

如图4所示，实验组（si-ANXA7）中PCNA的表达显著降低，而Cleaved casepase-3的表达显著增高。

图4 胃癌细胞增殖和凋亡相关蛋白表达

3 讨论

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，预后较差，手术治疗仍然是一线治疗方法，尽管已在外科技术、放疗、化疗等方面取得了进步，但胃癌仍然是全球癌症死亡的第二大原因。早期胃癌的5年生存率可达90%以上[5]，但由于早期诊断率低，大多数患者就诊时已是晚期。因此，寻找早期的敏感诊断指标及治疗靶点非常重要。

膜联蛋白A7是钙依赖性磷脂结合蛋白的一员，影响许多功能和代谢过程，并与许多肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关[6]。许多研究发现，在多种肿瘤中ANXA7的表达增高：Srivastava等[7]发现其在乳腺癌中ANXA7高表达，并发现ANXA7的表达水平与预后不良呈正相关；Hung等[8]研究表明，ANXA7高表达显著促进了恶性胶质瘤的发生；Sun等[9]研究发现，胃癌中ANXA7显著高表达，且其表达水平与远处转移呈正相关；袁虎方等[10]研究发现ANXA7在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。有研究证明，敲低人肝癌细胞中ANXA7可明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移[11]；敲低胃癌细胞中ANXA7导致细胞凋亡率显著增高[12]。多种研究结果表明，ANXA7的异常表达与多种肿瘤的发生、发展和转移、侵袭等过程密切相关，本实验通过敲低胃癌MGC-803细胞中ANXA7的表达，进一步阐明其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。

PCNA是一种细胞增殖核抗原，作为DNA聚合酶的附属蛋白，通过促进DNA聚合酶延伸DNA，促进细胞增殖[13]。Casepase是一组半胱氨酸蛋白酶，可特异性的断开天冬氨酸残基后的肽键，而Casepase-3是其中一种重要的剪切酶，在细胞凋亡过程中发挥着不可替代的作用，当细胞中的caspase-3被激活后，即成为cleaved caspase-3,可显著促进细胞的凋亡，因此cleaved caspase-3被认为是细胞凋亡的可靠标记。有研究发现，激活caspase-3活性可以显著抑制人骨髓瘤细胞增殖，诱导其凋亡[14]。Lin等[15]研究发现，上调caspase-3的活性可以抑制卵巢的生长。Zhou等[16]研究发现，抑制caspase-3的表达促进了人结肠癌的增殖。抑制caspase-3的激活可以降低胃癌细胞的凋亡[17]，而下调cleaved caspase-3的表达增强了胃癌细胞的增殖和迁移[18]。本实验发现，敲低胃癌MGC-803细胞中ANXA7的表达后，实验组PCNA的表达显著降低，而cleaved caspase-3的表达显著高于对照组。同时，实验组的细胞增殖显著降低而凋亡率显著高于对照组，表明低表达ANXA7后可能通过抑制PCNA表达的同时增加caspase-3的激活，从而抑制胃癌细胞的增殖，并促进胃癌细胞的凋亡。

综上所述，在胃癌MGC-803细胞中低表达ANXA7，可能在抑制PCNA表达的同时增加cleaved caspase-3的表达，抑制胃癌细胞的增殖，促进其凋亡，并有望通过更深层次的研究，使ANXA7成为胃癌诊断和治疗的新靶点。