葛根多糖抗氧化性及其降血糖作用研究

王秋丹，赵凯迪，林长青

（延边大学医学院中医系，吉林延吉 133000）

葛根（Pueraria，DC），又名葛藤、葛麻叶、野葛等，属豆科多年生缠绕藤本植物[1]，其主要分布在我国辽宁、河北、河南、山东、安徽等地，约占世界品种的50%[2]。于2000年葛根正式被国家卫生部批准列入“既是食品又是药品”名录[3−4]。此外，在《中国药典》、《中药大辞典》、《中华本草》等典籍中也有记载[5]。葛根含有黄酮类、三萜类、皂苷类和多糖类等多种化学成分，具有生津止渴、醒脾解酒、升阳止泻、降脂等功效，对心脑血管疾病、糖尿病、神经保护、解酒保肝和骨质疏松均有一定疗效，此外，其还能够调节肠道菌群[6−8]。许多植物多糖均具有生物活性，包括调节免疫力[9]、调节血糖血脂[10]、抗肿瘤[11]等内在的保健作用。

糖尿病（DM）是21世纪最重要的健康问题之一。1型糖尿病（T1DM）也称为胰岛素依赖型糖尿病（IDDM），从T1DM开始就依赖于胰岛素治疗，糖尿病作为近年来引起代谢紊乱的最常见疾病，其发病率在多数国家呈上升趋势[12]。糖尿病具有多种副作用，可导致组织损伤，体内脂质代谢紊乱，并最终降低糖尿病患者的生活质量[13−14]。

由于葛根富含多种营养活性成分，现已有多种以葛根或其提取物为原料制备的保健食品，如葛根解酒茶、葛根片、葛根口服液等。葛根对治疗糖尿病有良好的效果，葛根、葛根素单独应用或葛根与降糖药、胰岛素联合应用均可以显著降低2型糖尿病大鼠的血糖[15−16]。其主要通过改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞发挥降糖作用，葛根醇提物具有较强的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）活性抑制作用，可改善胰岛素抵抗人肝癌细胞HepG2的胰岛素敏感性并增强其葡萄糖摄取能力[17]。近年来，对葛根多糖的研究多集中于提取方法和纯化工艺的优化[18]、降血脂活性的研究[19]以及体外降血糖作用[20]，但对葛根多糖在治疗1型糖尿病方面的报道较少，因此，本试验中采用DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO清除率来测定葛根多糖的抗氧化性，采用腹腔注射STZ建立1型糖尿病模型，并对其各项指标进行测定，旨在为开发葛根成为新抗氧化和降血糖产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛根 吉林省益丰大药堂；抗坏血酸（VC） 中国医药集团有限公司；SD大鼠 50只雄性无特定病原体（SPF）级，体重（250±20）g，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，长春亿斯试验动物中心，严格遵守《延边大学试验动物的保护和使用指南》中的要求，符合动物试验伦理要求；高脂高糖饲料、普通饲料 上海帆泊生物技术有限公司；盐酸二甲双胍片 北京万辉双鹤药业有限责任公司；链脲佐菌素（STZ） 美国Sigma公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·） 上海化成工业有限公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS+·） 北京索莱宝科技有限公司；一氧化氮清除剂（PTIO） 北京绿源伯德生物科技有限公司；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒 江苏南京建城生物工程研究所。

HWS-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；ScoutSE-SE202FZH型电子天平 常州奥豪斯仪器有限公司；TG16A-WS型离心机 上海卢湘仪器有限公司；CCA-1111-CE 型旋蒸冷凝器东京理化器械株式会社；LyoQuest-55实验型冷冻干燥机 西班牙Telstar集团公司；DTC-22B型真空泵

日本ULUACKIKO公司；九安AG-605血糖仪及血糖试纸 天津九安医疗电子股份有限公司；BKEL10C酶标仪 山东博科生物产业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根多糖的提取 将葛根破碎，用40目型粉碎机进行粉碎，收集葛根粉末。参考马伟等[21]的方法，采用水提醇沉法对葛根多糖进行提取。按料液比1:20 g/mL，提取时间4 h，100 ℃水提2次，合并2次清液，抽滤，旋蒸，将浓缩液用85%乙醇进行醇沉，收集沉淀，蒸馏水复溶，旋蒸浓缩，采用Sevage法除蛋白，用冻干机进行冻干，收集粉末，按公式（1）计算多糖得率，4 ℃保存备用。

1.2.2 葛根多糖含量的测定 参考纪宝玉等[22]的方法，采用苯酚硫酸法进行多糖含量的测定。将葡萄糖配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的浓度梯度，按苯酚硫酸法步骤进行操作，测定490 nm处不同浓度葡萄糖的OD值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。称量葛根多糖粉末3 mg，蒸馏水定容至10 mL，取1 mL，加入1 mL 5%苯酚和5 mL的浓硫酸，混合后室温放置20 min，测定490 nm处的OD值。并计算葛根多糖含量。

1.2.3 葛根多糖抗氧化性的测定 按朱家庆等[18]的方法稍作修改，将葛根多糖溶于水配制成50、100、200、400、800、1000 μg/mL的溶液，以VC作为对照组，测定葛根多糖DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力。

1.2.4 试验动物分组及给药 选取50只SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养7 d，喂养7 d后，10只作为正常组，其余40只以30 mg/kg·BW剂量进行腹腔注射STZ，建立T1DM大鼠模型，72 h后进行血糖测定，尾尖取血，弃掉第一滴血，将第二滴血滴到血糖试纸上进行测定，FBG水平>16.7 mmol/L则造模成功[23]，将此时定为灌胃0周。将造模成功大鼠随机分为4组，每组10只，包括模型组、葛根多糖高剂量组（100 mg/kg）、葛根多糖低剂量组（50 mg/kg）、阳性对照组（100 mg/kg盐酸二甲双胍），剂量设定参照蔡春沉等[24]的方法。每天进行灌胃，连续灌胃8周，除试验组外，正常组和模型组每天以等量的蒸馏水灌胃，每周记录所有大鼠的体重和FBG。

1.2.5 大鼠OGTT的测定 在灌胃给药8周后，进行OGTT试验，以1 g/kg·BW灌胃葡萄糖，然后以0、30、60、90 min为时间点分别测定大鼠血糖水平，并记录其数值。严格遵守《延边大学试验动物的保护和使用指南》中的要求，符合动物试验伦理要求。

1.2.6 大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的测定 TC、TG：心脏取血，以4000 r/min，离心10 min，离心后取大鼠血清，依次按试剂盒说明书步骤进行操作，所有反应液混匀后，37℃孵育10 min，于510 nm测定吸光值，根据公式进行计算。HDL-C、LDL-C的测定：取大鼠血清，依次按试剂盒说明书步骤进行操作，所有反应液混匀后，分别孵育5 min，在546 nm测定2次吸光值，根据公式进行计算。

1.2.7 大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的测定 心脏取血，以4000 r/min，离心10 min，离心后取大鼠血清，按照试剂盒说明书中操作表进行操作，并用酶标仪测定各指标吸光度，最后按照公式进行计算。

1.3 数据处理

本试验使用SPSS 23.0对整理后的试验数据进行统计学分析，计算各组均值与标准偏差，进行单因素方差分析，所得的数据以图表和均值±标准偏差（X±SD）的形式表示，P<0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 葛根多糖含量的测定

多糖得率为9.87%，图1为多糖标准曲线，标准曲线方程为y=11.161x+0.001（R2=0.9965），计算出多糖含量为87.80%。

图1 多糖标准曲线Fig.1 Standard curve of polysaccharides

2.2 葛根多糖对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力

通过DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO清除率实验可判断物质的抗氧化能力。图2为葛根多糖在50、100、200、400、800、1000 μg/mL浓度下对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力，葛根多糖对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力与浓度呈正相关，在1000 μg/mL浓度下对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力分别为90.2%、83.3%、81.3%、89.0%。抗氧化性接近VC。可见，葛根多糖有一定的抗氧化性。

图2 葛根多糖对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力Fig.2 The ability of Pueraria lobata polysaccharide to remove DPPH·, ABTS+·, ·OH, PTIO

2.3 葛根多糖对大鼠体重、FBG的影响

由表1可知，在灌胃8周后，与正常组相比，T1DM大鼠的体重均显著降低（P<0.05），经葛根多糖治疗后的糖尿病大鼠体重下降得到有效的缓解，并与二甲双胍显示出相似的治疗效果。表2显示，灌胃8周后，实验组大鼠的FBG均显著高于正常组（P<0.05），但经葛根多糖治疗的T1DM大鼠FBG与模型组相比显著下降（P<0.05），与阳性组间差异不显著（P>0.05）。说明葛根多糖能够有效缓解T1DM大鼠体重的下降，降低其血糖水平。

表1 T1DM大鼠体重（g）Table 1 Body weight of T1DM rats (g)

表2 T1DM大鼠空腹血糖值（mmol/L）Table 2 Fasting blood glucose of T1DM rats (mmol/L)

2.4 葛根多糖对大鼠OGTT的影响

糖耐量作为糖尿病的一种重要指标，能够在一定时间内反映出机体对体内血糖浓度的调节能力，反映其葡萄糖耐受能力。图3为OGTT试验结果，结果显示，与正常组相比，T1DM大鼠的FBG水平在0、30、60和90 min时极显著增加（P<0.01），与模型组相比，经葛根多糖治疗后的大鼠血糖水平在30、60和90 min时极显著降低（P<0.01）。这表明葛根多糖能够有效控制大鼠的血糖水平，提高其糖耐量。

图3 葛根多糖对OGTT水平的影响Fig.3 Effects of Pueraria lobata polysaccharide on OGTT level

2.5 葛根多糖对大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响

血脂异常是胰岛素代谢失调引发的一种现象，胰岛素的缺乏会加速机体内脂肪的分解，脂肪分解所产生的游离脂肪酸进入肝脏生成TG和酮体，会使TC、HDL-C、LDL-C发生变化，最终导致体内血脂异常[25]。如图4所示，经葛根多糖治疗后，能够极显著降低T1DM大鼠TC、TG、LDL-C水平（P<0.01），极显著提高HDL-C水平（P<0.01）。由此可见，葛根多糖能够调节T1DM大鼠的异常脂代谢情况。

图4 葛根多糖对TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影响Fig.4 Effects of Pueraria lobata polysaccharide on TC、TG、HDL-C and LDL-C level

2.6 葛根多糖对大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影响

研究指出通过调节氧化应激相关酶的活力能够改善胰岛细胞的功能，促进葡萄糖代谢，减少对肝组织的损伤[26−27]。SOD、GSH、CAT和MDA的水平能够间接反映出脂代谢和氧化应激水平。如图5所示，与正常组相比，模型组中SOD、GSH、CAT含量均极显著下降（P<0.01），MDA含量极显著升高（P<0.01），经葛根多糖治疗后可有效恢复T1DM大鼠的SOD、GSH、CAT水平，有效降低MDA水平，且与模型组比较，高剂量葛根多糖组能够极显著提高SOD、GSH、CAT水平（P<0.01），极显著降低MDA水平（P<0.01）。

图5 葛根多糖对SOD，GSH，CAT和MDA水平的影响Fig.5 Effects of Pueraria lobata polysaccharide on SOD,GSH, CAT and MDA level

3 结论与讨论

植物多糖又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10的化合物，内部存在若干个α-或β-糖苷键，多糖广泛地存在于植物体内，是植物体内重要的活性物质，所以常被应用于食品、保健品中[28]。本试验中葛根多糖的得率为9.87%，测得多糖提取物中葛根多糖的含量为87.80%。

正常情况下，机体氧化还原系统处于动态平衡，当机体处于应激、病理状态时，会产生·OH、DPPH·等强氧化自由基[29]。植物多糖可通过直接或间接清除自由基、提高抗氧化酶活性或降低氧化酶活性起到抗氧化作用。刘雅娜等[30]利用水提醇沉法对沙棘多糖进行了提取，并测定了DPPH自由基清除率和ABTS+·自由基清除率，试验结果表明，沙棘多糖具有良好的抗氧化作用。另有学者研究了芽球菊苣根多糖和山药多糖的抗氧化性，均显示有很强的自由基清除能力[31−32]。本实验中，显示葛根多糖在50~1000 μg/mL范围内对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO均有一定的清除能力，且与浓度呈正相关，在1000 μg/mL浓度下对DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力分别为90.2%、83.3%、81.3%、89.0%。本研究结果与前人研究结果均显示植物多糖具有很好的抗氧化性。

目前公认的病因为在遗传及环境因素共同作用下，由T细胞免疫介导的胰岛β细胞破坏。胰岛β自身免疫破坏过程历时数月到数年，当胰岛β细胞破坏到一定程度时，糖尿病症状出现[33]。植物多糖因其特殊结构，使其具有多途径、多靶点、多向性、毒副作用小的药理优点，能够通过多种机制、多环节作用于糖尿病[34]。植物多糖降血糖的机制主要是增加胰岛细胞数量、促进胰岛素分泌或释放、增加胰岛素敏感性、改善糖代谢等[35]。

T1DM会导致机体内异常脂代谢情况的发生，导致体内TC、HDL-C、LDL-C发生变化[36−38]，其中，甘油三酯水平显著升高为1型糖尿病最为突出的脂代谢紊乱表现[39]。研究指出，葛根多糖有着良好的降血脂活性[19]。在本试验中，与正常组相比，T1DM大鼠血清的TC、TG、LDL-C浓度显著增加（P<0.01），而HDL-C浓度显著降低（P<0.01），表明T1DM大鼠出现了异常的脂代谢情况，其原因可能是T1DM大鼠对葡萄糖利用失调，脂肪分解增加，从而产生了大量的游离脂肪酸，组织吸收脂肪酸的能力降低，FFA大量释放到血液和肝脏中，导致TC、TG、LDLC的含量增多。与模型组比较，经葛根多糖灌胃后的T1DM大鼠的TC、TG、LDL-C显著降低（P<0.01），HDL-C显著升高（P<0.01）。葛根多糖促进了组织对脂肪酸的吸收，从而缓解了一场脂代谢的情况。

糖尿病患者机体内氧自由基含量增多，过多的氧自由基与脂质相互作用产生过氧化反应[40]。CAT与SOD在机体中具有较强的抗氧化能力，在体内能够抑制氧自由基的生成，能够减少氧自由基对细胞造成的伤害，并且能够降低MDA的生成量[41]。在本试验中，与正常组相比，T1DM大鼠血清的MDA浓度显著增加（P<0.01），而SOD、GSH、CAT浓度显著降低（P<0.01），表明T1DM大鼠出现了氧化应激反应。与模型组大鼠相比，葛根多糖治疗后能够显著抑制这些标志物的变化，可能是通过调节体内相关酶的水平从而提高了清除自由基的效果。

由此，我们认为，葛根多糖具有良好的抗氧化活性，并可以通过调节T1DM大鼠脂代谢及氧化应激反应，从而降低T1DM大鼠血糖。