硫酸盐还原菌原位合成纳米硫化亚铁还原Cr（Ⅵ）

胡 凡，陈元彩，胡勇有，程建华

（华南理工大学 环境与能源学院工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室，广东 广州 510006）

铬污染物主要来源于电镀、染料、制革、木材防腐等行业排放的工业废水，常以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）两种价态存在［1］。Cr（Ⅵ）具有四面体结构，可通过细胞膜进入细胞内，破坏生物体的细胞结构，其生物毒性是Cr（Ⅲ）的100倍［2］。因此，处理含铬废水的主要目标是将Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ）。传统的物理化学法费用高，存在二次污染。生物法因其兼具经济与环境效益而受到广泛的重视［3］，但微生物代谢过程中缓慢的电子传递速率以及重金属的生物毒性效应限制了生物修复在废水处理领域的应用［4］。

纳米硫化亚铁（Nano-FeS）由于具有良好的吸附性、还原性被广泛应用于水中污染物的处理。生物合成的Nano-FeS不仅能克服纳米粒子不稳定、易团聚的缺陷，还能弥补细胞膜导电性差的短板［5］，为微生物的胞外电子传递提供电子传输通道，加快胞外呼吸速率［6］。因此利用微生物合成Nano-FeS是一种很有前景的废水原位处理方法。

本研究利用硫酸盐还原菌（SRB）原位合成Nano-FeS，构建Nano-FeS协同SRB（Nano-FeS@SRB）体系还原Cr（Ⅵ），为含Cr（Ⅵ）废水的处理提供新的思路和理论依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

FeCl2·4H2O、NaOH、H2SO4（98%（w））、重铬酸钾、卡那霉素：均为分析纯。

MLS-3705型高压灭菌锅：日本三洋公司；LGJ-10型冷冻干燥机：北京松源华兴公司；DR 6000型紫外-可见分光光度计：美国哈希公司；PH3C型台式pH计：上海仪点科技仪器股份有限公司；BT125D型电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；CHI832D型电化学工作站：上海辰华仪器有限公司。

基础培养基溶液：Na2SO40.72 g/L，K2HPO4·3H2O 0.60 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，MgCl2·6H2O 0.06 g/L，乳酸钠2 mL/L。

1.2 Nano-FeS@SRB体系的构建

配制基础培养基溶液1 L，用0.5 mol/L的NaOH溶液和1.0 mol/L的H2SO4调节pH至7.0。为避免乳酸钠在高温条件下发生反应，将乳酸钠放入超净台开启紫外灯灭菌30 min以上，其他培养基物质在121 ℃灭菌30 min，将乳酸钠与其他培养基物质混合后再加入0.15 g FeCl2·4H2O。

取200 mL上述培养基溶液置于250 mL的厌氧瓶中，将培养好的SRB加入培养基中，使最终OD600= 0.1。向厌氧瓶中通入氮气15 min后立即封闭，并将其置于恒温摇床中培养，温度为30 ℃，转速为140 r/min。7~9 d后，将得到的Nano-FeS@SRB溶液在厌氧工作台中用氮气吹脱过的去离子水洗涤，离心并收集。

1.3 Nano-FeS@SRB体系还原Cr（Ⅵ）

取SRB和Nano-FeS@SRB溶液各10 mL，用去离子水洗涤，离心吸除上清液后，分别加入200 mL Cr（Ⅵ）质量浓度为10 mg/L或20 mg/L的K2Cr2O7溶液（模拟含铬废水）。每隔一定时间吸取10 mL上清液测定溶液中Cr（Ⅵ）的质量浓度。

1.4 分析表征方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法［7］（GB 7467—1987）测定溶液中Cr（Ⅵ）的质量浓度；采用考马斯亮蓝分光光度法［8］测定蛋白质浓度；采用X射线衍射仪（Empyrean型，荷兰帕纳科公司）和X射线光电子能谱仪（UlraDLD型，英国Kratos公司）对反应前后的物质进行表征。

1.5 Nano-FeS对微生物电子传递性能的影响实验

1.5.1 电化学实验

采用循环伏安法（CV）和恒电位法（I-t）测定微生物的电化学性能。采用标准三电极电解池，使用铂丝作对电极、玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl电极为参比电极［9］，用基础培养基溶液（pH=7.0）作电解液。实验前对玻碳电极进行抛光打磨，并将电解池中的电解液通氮气15 min，去除其中的氧气后，将通气管提高到液面上方继续通氮气以保持厌氧环境。随后吸取洗涤离心后的SRB和Nano-SRB@FeS溶液各10 μL至工作电极表面，并加入适量1% Nafion溶液固定，待自然晾干固定后分别进行测试。循环伏安法中设置电势增量6 mV，脉冲幅度60 mV，脉冲宽度0.2 s，扫描范围-0.8~0.8 V，扫描速率10 mV/s。恒电位法中电压控制在-0.40 V。

1.5.2 电子传递抑制剂实验

取SRB和Nano-FeS@SRB溶液各10 mL，洗涤离心吸除上清液后分别加入K2Cr2O7溶液。通过加入不同的电子传递抑制剂（0.2 mmol/L双香豆素；0.1 mmol/L辣椒素和0.1 mmol/L鱼藤酮混合物；0.2 mmol/L噁唑菌酮）阻断Cr（Ⅵ）还原过程中的生物电子传递，来判断Nano-FeS的主要作用位点。

1.6 Nano-FeS@SRB体系还原Cr（Ⅵ）的单因素实验

分别考察Cr（Ⅵ）初始质量浓度（5，10，15，20，25 mg/L）、温度（25，30，35，40 ℃）和pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）对Nano-FeS@SRB体系还原Cr（Ⅵ）效果的影响，24 h后测定溶液中残留Cr（Ⅵ）质量浓度，并计算Cr（Ⅵ）去除率。

2 结果与讨论

2.1 表征结果

Nano-FeS@SRB的XRD谱图见图1。由图1可见：在2θ为16.35°、28.52°和50.50°处有四方硫铁矿FeS的特征峰，分别对应着FeS在（010）、（111）和（122）晶面的衍射峰，证实了FeS的形成。结晶性差是由于中性pH条件和较短的生长周期导致的［10-11］。

图1 Nano-FeS@SRB的XRD谱图

Nano-FeS@SRB的XPS谱图见图2。由图2a可见：Fe 2p的峰位置在709.6，713.2，725.6 eV处，分别对应 Fe（Ⅲ）—S、Fe（Ⅲ）—O和Fe（Ⅱ）—S［12-15］，其中FeS质量分数为53%，表明在制备过程中FeS表面发生了部分氧化。由图2b可见：S 2p的峰位置在161.0，162.2，163.8，168.7 eV处，分别对应S2-、Sn2-、S0和SO42-，其中S0是SRB异化硫酸盐过程中的中间产物。由图2c可见：C 1s的峰位置在284.9，286.2，288.0 eV处，分别对应C—C、C—O和C=O，可能与细胞表面的生物组分相关［16］。

图2 Nano-FeS@SRB的XPS谱图（Fe 2p（a）、S 2p（b）和C 1s（c））

2.2 Nano-FeS@SRB体系还原Cr（Ⅵ）的性能

SRB和Nano-FeS@SRB体系中Cr（Ⅵ）和蛋白质质量浓度的变化见图3。由图3a和图3b可见：当Cr（Ⅵ）初始质量浓度为10 mg/L时，SRB和Nano-FeS@SRB体系对Cr（Ⅵ）的去除效果符合准一级动力学模型，SRB体系中Cr（Ⅵ）的反应速率常数为2.47×10-6s-1，而Nano-FeS@SRB体系中Cr（Ⅵ）的反应速率常数为2.60×10-4s-1，比SRB高两个数量级，完全去除时间从5 d降至7 h，说明Nano-FeS@SRB体系具有较高的Cr（Ⅵ）还原能力。由图3a可见，前2 d内SRB体系中蛋白质质量浓度没有明显提升，SRB细胞生长受到抑制；而图3d中Nano-FeS@SRB体系中细胞生长延迟期消失，说明Nano-FeS可以有效缓解Cr（Ⅵ）对SRB细胞生长的抑制作用。

由图3c和图3d可见：当Cr（Ⅵ）初始质量浓度为20 mg/L时，在第2天加入卡那霉素（一种阻止蛋白质合成并最终导致细胞死亡的氨基糖苷类抗生素），微生物的生长立即停止，Cr（Ⅵ）的反应速率常数由1.07×10-5s-1急剧降至2.08×10-8s-1后停止，表明Nano-FeS@SRB体系中Cr（Ⅵ）的还原是微生物介导的过程。

图3 SRB和Nano-FeS@SRB体系中Cr（Ⅵ）和蛋白质质量浓度的变化

还原产物的XPS谱图见图4。其中FeS的质量分数为47%，可见FeS在还原Cr（Ⅵ）后并没有发生显著损耗，主要在于细胞生物质对纳米粒子的稳定作用和SRB的电子传递能力。由图4c可见：Cr 2p3/2在576.8 eV和577.7 eV处的峰分别对应Cr2O3和Cr（OH）3；在587.1eV处的峰对应Cr 2p1/2中的FexCr1-x（OH）3或Fe（OH）3-Cr（OH）3［17］，表明还原产物中的铬主要以Cr（OH）3的形式存在，少量以Cr2O3的形式存在。产物中S0的质量分数为27%，说明在Cr（Ⅵ）存在的条件下，部分FeS表面的硫化物被氧化为S0；SO42-的质量分数为23%，说明Cr（Ⅵ）和SO42-均可以作为电子受体，接受来自细胞代谢产生的电子。

图4 还原产物的XPS谱图（S 2p（a）、Fe 2p（b）和Cr 2p（c））

2.3 Nano-FeS对微生物电子传递性能的影响

2.3.1 电化学性能分析

SRB和Nano-FeS@SRB的I-t曲线和循环伏安曲线见图5。由图5a可见：在SRB的实验组中，电流的增加可以忽略不计；在Nano-FeS@SRB的实验组中，在实验0.65 h时电流迅速增加至50 μA，表明Nano-FeS的加入增强了SRB的胞外电子传递；在实验1.80 h加入可使细胞灭活的卡那霉素时，电流在微生物应激反应下急剧增加到54 μA后立即降至8 μA，说明阴极产生的电流与微生物细胞代谢有关。

由图5b可见：在SRB的实验组中没有观察到明显的氧化还原峰；在Nano-FeS@SRB实验组中，除-0.8 V处氢还原峰外，还在-0.4 V处出现了明显的还原峰，说明Nano-FeS的存在对SRB内的氧化还原反应具有强化作用。电化学实验表明，Nano-FeS增强了SRB的胞外电子传递。

图5 SRB和Nano-FeS@SRB的I-t曲线 （a）和循环伏安曲线（b）

2.3.2 电子传递抑制剂的作用

不同抑制剂条件下的Cr（Ⅵ）去除率和抑制率见图6。由图6a可见：添加双香豆素、鱼藤酮与辣椒素的混合物及噁唑菌酮后，SRB对Cr（Ⅵ）的去除率从38%下降至15%、24%和11%，其抑制率分别达到58.39%、36.29%和71.07%，主要是因为竞争性抑制剂双香豆素可以与复合体I结合，阻碍电子由复合体I向醌池的传递；而噁唑菌酮可以抑制电子向外膜细胞色素c的传递。Nano-FeS@SRB体系中，双香豆素和噁唑菌酮的抑制作用得到缓解，抑制率分别降至11.59%和5.71%，主要是由于导电性纳米粒子具有高亲和力，可以附着于复合体I，占据抑制剂双香豆素的结合位点，以促进细胞电子转移，并且Nano-FeS还可以作为电子导管代替受抑制的细胞色素c接受细胞代谢产生的电子并将其传递给Cr（Ⅵ）。电子传递抑制剂实验结果说明Nano-FeS对细胞的电子传递具有积极作用，可以作为电子穿梭体将细胞代谢产生的电子传递给胞外Cr（Ⅵ），实现Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的还原。

图6 不同抑制剂条件下的Cr（Ⅵ）去除率（a）和抑制率（b）

2.4 Nano-FeS@SRB体系去除Cr（Ⅵ）的影响因素

2.4.1 Cr（Ⅵ）初始质量浓度

在反应温度为30 ℃、体系pH为7.0的条件下，Cr（Ⅵ）初始质量浓度对Cr（Ⅵ）去除率的影响见图7。由图7可见：随着Cr（Ⅵ）初始质量浓度的升高，Cr（Ⅵ）去除率显著降低。这是因为：Cr（Ⅵ）初始质量浓度低于10 mg/L时，Nano-FeS过量，Cr（Ⅵ）去除率接近100%，随着Cr（Ⅵ）初始质量浓度升高，化学反应趋于平衡，Cr（Ⅵ）去除率开始下降；另一方面，在Cr（Ⅵ）初始质量浓度较高的条件下，SRB会发生蛋白质变性，造成微生物中毒，使Cr（Ⅵ）去除率降低。

图7 Cr（Ⅵ）初始质量浓度对Cr（Ⅵ）去除率的影响

2.4.2 反应温度

在Cr（Ⅵ）初始质量浓度为20 mg/L、体系pH为7.0的条件下，反应温度对Cr（Ⅵ）去除率的影响见图8。由图8可见：随着反应温度的升高，Cr（Ⅵ）去除率先升高后降低；当反应温度为25 ℃时，Cr（Ⅵ）去除率为47%；当反应温度为35 ℃时，Cr（Ⅵ）去除率增加至77%。这是因为温度升高，酶活性增加，活化分子数增加，反应速率加快，因而Cr（Ⅵ）去除率升高。当反应温度升至40 ℃时，Cr（Ⅵ）去除率相较35 ℃有所下降，这是因为大多数SRB的最适生长温度为30~35 ℃，温度过高，SRB的生长受到抑制［18］。本实验选择反应温度为35 ℃较适宜。

图8 反应温度对Cr（Ⅵ）去除率的影响

2.4.3 体系pH

在Cr（Ⅵ）初始质量浓度为20 mg/L、反应温度为35 ℃的条件下，体系pH对Cr（Ⅵ）去除率的影响见图9。由图9可见：当体系pH为5.0时，24 h内Cr（Ⅵ）去除率达93%；随着体系pH升高，Cr（Ⅵ）去除率逐渐下降。这是因为：一方面，FeS的溶解度随pH的升高而下降，高pH条件下，FeS溶解产生的还原性Fe2+和S2-均急剧减少，Cr（Ⅵ）还原速率减慢；另一方面，溶液pH大于FeS的等电点（≈7.5）时，FeS与Cr（Ⅵ）之间存在静电斥力［19］，不利于Cr（Ⅵ）的吸附，因而Cr（Ⅵ）的去除率下降。

图9 体系pH对Cr（Ⅵ）去除率的影响

3 结论

a）在Cr（Ⅵ）初始质量浓度为10 mg/L的条件下，Nano-FeS@SRB体系中Cr（Ⅵ）的去除速率远高于SRB体系，说明Nano-FeS@SRB具有较高的Cr（Ⅵ）还原能力，Nano-FeS@SRB体系中Cr（Ⅵ）的还原是微生物介导的过程。经Nano-FeS@SRB体系处理后，Cr（Ⅵ）被转化为低毒的Cr（OH）3和Cr2O3，极大程度地降低了Cr（Ⅵ）对生物和环境的危害。

b）电化学实验表明，Nano-FeS的加入增强了SRB的胞外电子传递，可以作为电子穿梭体将细胞代谢产生的电子传递给Cr（Ⅵ），实现Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的还原。

c）在Cr（Ⅵ）初始质量浓度为20 mg/L、反应温度为35 ℃、体系pH为5.0的条件下，Cr（Ⅵ）去除率为93%。