气相色谱法测定乳及其制品中肌醇含量的方法优化

黄 中，梁依依

百跃羊乳（南宁）有限公司，广西南宁530105

0 引言

肌醇，别名肌糖、环己六醇、纤维醇，化学式（CHOH）6，广泛分布在动植物体内，是动植物和微生物的生长因子[1]；可由玉米浸泡液中提取，具有类似维生素B1和生物素的作用，可使脂肪很快转化为热能而被消耗，有效预防在人体内特别是心血管内的沉积[2]。《GB 14880—1994 食品营养强化剂使用卫生标准》实施后，肌醇常作为营养强化剂，加入保健食品、婴幼儿配方乳粉和儿童调制乳粉中。《GB 14880—2012 食品营养强化剂使用标准》中调制乳粉肌醇添加要求为210~250 mg/kg，《GB 10765—2021 食品安全国家标准婴儿配方食品》《GB 10766—2021 食品安全国家标准较大婴儿配方食品》《GB 10767—2021 食品安全国家标准幼儿配方食品》中肌醇限量为1.0~9.6 mg/100 kJ。目前，检测食品中肌醇含量的国标法有气相色谱法、微生物法、化学法。除国标法外，部分学者还开发了液相色谱法[3]、气质联用法[4]、液质联用法[5，6]、离子色谱法[7]、毛细管电泳法[8]。其中气相色谱法是利用硅烷化试剂与肌醇衍生反应，使肌醇的6 个羟基均被硅烷化试剂衍生成六（三甲硅氧基）环己烷，其具有挥发性，以利于用气相色谱进行定量分析[9]。而国标法-气相色谱法测定食品中肌醇含量的方法存在旋转蒸发、离心等操作步骤繁琐，结果稳定性不高，检测时间长的不足。试验拟在《GB 5009.270—2016 食品安全国家标准 食品中肌醇的测定》第二法气相色谱法的基础上进行优化，通过优化前处理步骤和仪器色谱条件，缩减前处理时间和色谱分析时间，使检测方法更方便、更快速、更精准、更节约。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

肌醇标准品，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；正己烷，色谱纯，西陇科技股份有限公司，无水乙醇，色谱纯，西陇科技股份有限公司；三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺，分析纯，西陇科技股份有限公司；0.22 μm微孔滤膜；25 mL带金属螺纹盖的顶空瓶，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.1.2 仪器

超声波清洗机：KQ700DE，昆山舒美超声仪器有限公司；离心机：TG16-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司；电热鼓风干燥箱：DHG-9240A，上海一恒科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；气相色谱仪：7890A，安捷伦科技（中国）有限公司；电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 样品前处理

1.2.1 溶解

称取1 g样品于25 mL容量瓶中，加入7.5 mL 40 ℃温水溶解，超声20 min。

1.2.2 沉淀

将溶解好后的样液，用无水乙醇定容，静置20 min，转移至50 mL的离心管，以不低于4 000 r/min离心5 min。

1.2.3 衍生与提取

吸取上清夜2.5 mL于顶空瓶中，放至于鼓风干燥箱中（103±2）℃烘干2 h。待冷却后，加入10 mL按8:2:1混合后的N-N二甲基甲酰胺、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷，拧紧盖子超声5 min后置于（80±5）℃水浴锅中水浴75 min。每隔20 min取出上下震摇，衍生后加入5 mL正己烷，反复振荡提取3 min，静置分层。在带有0.22 μm微孔滤膜的注射器中加入少量无水硫酸钠，吸取上层清液加入注射器中。弃除1~2 mL滤液后获取待测液。

1.3 肌醇标准测定液的制备

称取（105±1）℃烘干2 h的肌醇标准品100 mg，加水溶解定容至100 mL。吸取10 mL 1 mg/mL的标准溶液移至100 mL的容量瓶中，加入20 mL的水，混匀后加无水乙醇定容。分别吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的0.1 mg/mL的标准工作液至顶空瓶中，放至于鼓风干燥箱中（103±2）℃烘2 h，其余步骤同1.2.3。

1.4 仪器条件

色谱柱：安捷伦HP-5（填料（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷，柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚0.25μm）；进样口温度：280 ℃；检测器温度：300 ℃；色谱柱流量：3 mL/min；

分流比：10:1；进样量：1 μL；程序升温条件：初始120 ℃，以10 ℃/min升至190 ℃，保持8 min；再以40 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

对比国标法的制备，本方法将中间液的浓度提高了10 倍，以减少加入顶空瓶中标准工作液的量，加快干燥的时间。将肌醇含量0.02 mg、0.04 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg作为横坐标，检测的峰面积为纵坐标，绘制出肌醇含量的标准曲线，测得线性关系y=511.81x+0.2074，其相关系数0.9996，表明在0.02~0.12 mg范围内具有良好的线性，满足对肌醇的定量分析检测（图1）。

图1 标准曲线

2.2 前处理优化对肌醇测定的影响

对比国标法的前处理，直接干燥代替旋转蒸发干燥，样品定容体积和吸取上清液的体积减少1/2。在控制干燥时间的同时，也为了在大批量的试验中控制乙醇在鼓风干燥箱的挥发量，确保试验的安全性。带有无水硫酸钠的注射器过滤除水方式代替带有无水硫酸钠的离心管，减去离心管离心除水的步骤，对用优化后的前处理与国标前处理分别进行分析，分别对3 个样品用国标法与本方法进行测试。结果如表1所示，相对偏差分别为4.5%、1.5%、1.2%。前处理改变后减少了试剂用量，提高了检测效率，同时保证了结果与国标法的一致性。

表1 国标法与本方法的肌醇测定对比结果

2.3 色谱条件对肌醇测定的影响

国标法程序升温单次运行63 min，本试验使用HP-5的气相色谱柱进行试验，优化了升温程序，该法具有良好的重线性及分离度。如图2所示，单次进样仅21.25 min，减少了样品检测的分析时间。

图2 标准液与样品液色谱图

2.4 两种不同的处理方式对肌醇测定的影响

为了探讨样品在不去除蛋白质的情况下直接进行干燥衍生对肌醇测定的影响。称取1 g样品按1.2-1.4的方法处理进行3 个平行测试，另称取0.2 g于顶空瓶中，放置于鼓风干燥箱中（103±2）℃烘2 h，衍生提取测定同1.2-1.4步骤。结果如表2所示，未经沉淀蛋白处理的结果平均值与沉淀处理的相对偏差为2.34，但未经沉淀处理的结果稳定性不高，RSD值为8.05%。该处理方式对样品的均匀性、称样准确度、人员操作有比较大的要求。

表2 试验经沉淀蛋白处理与未经沉淀蛋白的结果对比

2.5 方法学验证

2.5.1 精密度测试

分别对2 个不同含量的样品按1.2-1.4方法处理的6 个平行样进行测试，结果如表3显示，2 个不同样品进行6 平行测试后，变异系数分别为2.47、0.43，均小于3.8。符合实验室质量控制规范食品理化检测的要求。

表3 样品精密度测试的分析结果

2.5.2 加标回收率的测试

对已知的样品称取1 g，分别加入0.2 mL、0.5 mL、1 mL浓度为1 mg/mL的标准储备液，按1.2-1.4方法处理，每个梯度进行3 个水平测试。结果如表4所示，加标回收率分别为100.3%、97.8%、95.1%，均在95%~105%范围内。符合实验室质量控制规范食品理化检测的要求。9 个样品的加标回收率相对标准偏差为2.55%，说明本方法具有良好的准确性和可靠性。

表4 加标回收率的分析结果

3 结论

与国标对比，对样品的溶解、标品配制、干燥衍生、色谱条件进行了改变，试样液经过气相色谱分析。结果显示，0~ 0.12 mg含量范围，相关线性R=0.9996，线性良好。样品的三梯度加标回收率分别为100.3%、97.8%、95.1%，RSD为2.55%。色谱条件优化后进样测试时间由63 min缩短至21.5 min。前处理方法缩减了旋转蒸发、离心脱水的步骤，很大程度上缩短检验时间、减少乙醇试剂用量、降低检验成本及前处理过程对检验员的危害。有利于大批量的试样处理，同时保证检验的精密度、准确度不受影响。