桑椹菌核病绿色防控药剂筛选试验

刘筱雪 王 一 曾泽彬 李冬兵 周 丽 王洪江 兰凤杰 刘学锋

(宜宾市农业科学院，四川宜宾 644000)

桑椹菌核病(mulberry fruit sclerotiniosis)，俗称白果病，是果桑种植区普遍发生的一类真菌病害，具有毁灭性危害，严重威胁果桑产业的发展。根据感染桑椹的病原菌不同，又将桑椹菌核病分为桑椹肥大性菌核病(hypertrophy sorosis scleroteniosis)、桑椹缩小性菌核病(reduced sorosis scleroteniosis)和桑椹小粒性菌核病(small particles sorosis scleroteniosis)3种类型[1-3]。其中，桑椹肥大性菌核病的发病率最高，危害也最为严重，发病率占桑椹菌核病总量的80%以上[2]。目前，已报道的桑椹菌核病病原菌有4种[1-4]，但是较常见的有3种，即引起桑椹肥大性菌核病的桑实杯盘菌(Ciboriashiraiana)，引起桑椹缩小性菌核病的白井地杖菌(Mitrulashiraiana)以及引起桑椹小粒性菌核病的肉阜状杯盘菌(Ciboriacarunculoides)。

桑椹菌核病的防控方法包括化学、物理、农业等手段。其中，化学防控是目前控制桑椹菌核病的主要手段，生产上常用70%甲基硫菌灵或50%多菌灵进行防控[1]，吕蕊花等[5]研究发现草甘膦对桑椹菌核病也有良好的防控效果。合理地使用这些药剂可以有效控制桑椹菌核病的发生及减轻危害程度。然而，这些药剂属于低毒或有毒药物，对环境、食品以及人体存在潜在危害，长期使用还会导致病原菌产生抗药性。因此，急需筛选出绿色无污染的高效杀菌剂。近年来，植物精油、脂肪酸、二氧化氯、水杨酸、壳聚糖、草酸钠、氯化钙、海藻酸钠等新型绿色杀(抑)菌剂和植物诱抗剂在食品业和农业得到广泛研究和应用[6-13]。由此，本研究选择了10种绿色低毒药剂开展桑椹菌核病的防治试验，旨在筛选出安全、高效的防控药剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

图1 DGF1的菌落形态(A)和子实体(B)

1.1.1 供试菌株 桑椹肥大性菌核病菌株编号DGF1(图1)，由宜宾市农业科学院蚕桑和食用菌研究实验室从患病桑椹分离所得。将菌株ITS序列提交到NCBI进行BLAST分析，结果显示菌株DGF1与Genbank中Ciboriashiraiana(JF816240.1)的同源相似性高达99%，结合菌落形态与分子鉴定，将其鉴定为Ciboriashiraiana。

1.1.2 供试药剂 70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，农药登记证号PD20085037，江苏龙灯化学有限公司产品；50%多菌灵可湿性粉剂，农药登记证号PD85150-35，四川国光农化股份有限公司产品；99%香芹酚、98%百里香酚、99.5%水杨酸，均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；肉桂酸、草酸钠、氯化钙、海藻酸钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；11%脂肪酸乳油，海厄滋生物科技有限公司产品；18%二氧化氯消毒剂(粉剂)，昆明双玖消毒药业有限公司产品；壳聚糖，生物纯，北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 E.Z.N.A. Fungal DNA Kit 试剂盒(D3390)，美国OMEGA生物公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 药剂室内筛选试验 药剂室内筛选试验采用菌丝生长速率法和最小抑制浓度法(minimal inhibitory concentration, MIC)[14]进行。(1)药剂初筛试验：分别将脂肪酸等10种绿色低毒药剂用含0.5%吐温-80的无菌水配制成终浓度为稀释1 000倍的药物平板，以同样处理的甲基硫菌灵和多菌灵2种传统化学药剂为药物对照，以不加药物的PDA平板为空白对照，每个培养皿接入培养至对数期、直径为8 mm的病原菌菌块，置于25 ℃培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径。每个处理3个重复。(2)药剂梯度试验：采用同样的方法进行梯度试验,分别将药剂初筛试验筛选出的脂肪酸等6种绿色低毒药剂用含0.5%吐温-80的无菌水配制成终浓度为稀释500倍、750倍、1 000倍、1 250倍、1 500倍的药物平板，以同样处理的甲基硫菌灵和多菌灵2种传统化学药剂为药物对照，以不加药物的PDA平板为空白对照。根据公式计算药剂的相对抑制生长率：菌落净直径=菌落直径-菌丝块直径；相对抑制率(%)=[(对照菌落净直径-处理菌落净直径)/对照菌落净直径]×100。

1.2.2 药剂大田试验 药剂大田试验于2021年2—5月份，在宜宾市农业科学院大观科研基地开展，果桑品种为粤椹大十，树龄6年。试验分别设置脂肪酸、香芹酚以及二氧化氯等的500倍稀释药液3个绿色低毒药剂处理，以70%甲基硫菌灵500倍稀释药液(甲基硫菌灵安全性比多菌灵高，且多菌灵正在逐渐被禁用，因此，大田试验未选用多菌灵)为药物对照，以喷施清水作空白对照(CK)，每处理设3个重复，每小区面积60 m2。每小区选择有代表性的3株桑树，每株定点调查3个枝条，统计每个枝条上桑椹的总数和病椹数，计算每株桑树的发病率。用危害严重度分级法统计病情指数，共分为0～4级：0级为桑椹全果健康，代表分值为0；1级为桑椹的病小核果占全果面积1/4以下，代表分值为1；2级为桑椹的病小核果占全果面积1/4～1/2，代表分值为3；3级为桑椹的病小核果占全果面积1/2～3/4，代表分值为5；4级为桑椹的病小核果占全果面积3/4以上，代表分值为10。

第1次施药从桑花初开时开始，之后每隔7 d喷药1次，每次喷雾以滴水为度，直到部分桑椹由青变红时停止施药。施药停止后，每7 d调查1次，直至病果不再增加即调查结束。根据公式计算发病率和相对防效：发病率(%)=(发病植株数/调查植株总数)×100；病情指数(%)=[∑(各级病椹数×各级代表值)/(调查病椹总数×最高级别代表值)]×100；相对防效(%)=[(对照区发病率-防治区发病率)/对照区发病率]×100。

1.3 数据处理

用SPSS 22.0软件处理试验数据，采用ANOVA法进行方差分析，并用Duncan’s新复极差法比较数据间的差异显著性。通过SPSS 22.0软件分析，取药剂质量浓度为X，抑制率值为Y，得到毒力回归方程并计算药物抑制中浓度(EC50)。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对Ciboria shiraiana的抑制效果

药剂初筛试验比较了10种绿色低毒药剂与2种传统化学药剂的1 000倍稀释药液对Ciboriashiraiana菌丝生长的作用情况。从表1可以看出，脂肪酸对Ciboriashiraiana的抑制效果最好，相对抑制率达99.21%，与传统化学药剂甲基硫菌灵和多菌灵的效果相当。其次为香芹酚，相对抑制率为96.38%。二氧化氯、水杨酸和百里香酚的抑制效果较好，相对抑制率分别为93.23%、90.55%、89.76%。肉桂酸和壳聚糖的抑制效果较差，相对抑制率分别为67.32%和23.15%。草酸钠、氯化钙和海藻酸钠对Ciboriashiraiana没有抑制效果。

表1 不同药剂对Ciboria shiraiana的抑制效果

表中不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 不同药剂对Ciboria shiraiana的药物抑制中浓度(EC50)

从表2可以看出，药剂的抑菌效果与药物浓度呈正相关。其中，香芹酚的EC50最低，仅为62 mg/L，说明Ciboriashiraiana对香芹酚表现出较高的敏感性，在较低的浓度下即有较强的抑制效果。里香酚与香芹酚是同分异构体，但百里香酚的EC50为382 mg/L，两者的EC50相差近6倍，说明两者分子结构的差异(酚羟基位置不同)导致了抑菌效果的不同，而香芹酚的构型更有利于对Ciboriashiraiana的抑制作用。肉桂酸的EC50最高，达902 mg/L，说明Ciboriashiraiana对肉桂酸敏感性较低。水杨酸是肉桂酸的衍生物，EC50为475 mg/L，说明Ciboriashiraiana对其敏感性也较低。脂肪酸和二氧化氯的EC50分别为311 mg/L和322 mg/L，与传统化学药剂的效果相当。综上所述，香芹酚、脂肪酸和二氧化氯具有防控桑椹肥大性菌核病的潜力。

表2 不同药剂对Ciboria shiraiana的药物抑制中浓度(EC50)

2.3 不同药剂对桑椹菌核病的大田防控效果

从表3和图2可以看出，粤椹大十在宜宾的桑椹菌核病发病高峰期在4月初。大田试验结果表明，香芹酚处理的发病率为3.19%～18.59%，病情指数为0.95～13.01；二氧化氯处理的发病率为0.32%～19.29%，病情指数为0.10～13.09；脂肪酸处理的发病率为1.41%～12.18%，病情指数为1.13～8.17；甲基硫菌灵处理的发病率为0.42%～8.26%，病情指数为0.12～4.97；空白对照的发病率为1.47%～19.35%，病情指数为1.45～13.61。由此可知，在田间环境下，香芹酚和二氧化氯对桑椹菌核病没有明显的防治效果；甲基硫菌灵对桑椹菌核病的防控效果最好，相对防效为41.10%～83.60%；脂肪酸相对于香芹酚和二氧化氯对桑椹菌核病的防控效果较好，相对防效为4.08%～46.93%。

表3 不同药剂对桑椹菌核病的大田防控情况

图2 不同药剂对桑椹菌核病的大田防控效果折线图

3 讨论

桑椹菌核病是果桑产业面临的一大难题，该病只能防不能治，具有来势猛、发病快的特点，其危害往往是毁灭性的，因此必须加强对桑椹菌核病的防控力度。多菌灵和甲基硫菌灵是桑椹菌核病最常用的防治药物，其中，多菌灵的残效期比较长，对哺乳动物有一定的毒害性[15]。目前，多菌灵已在美国禁用，中国及欧盟等多个国家(地区)也在逐步限制其使用；相对于多菌灵，甲基硫菌灵的安全性更高，但其在植物体内可转化为多菌灵，其潜在毒性也值得进一步研究[16]。因此，急需筛选出针对桑椹菌核病的安全、高效防控药物。

植物精油是一类植物源次生代谢物质，具有抗菌、防腐、高效、低毒、易降解和对环境污染小等特点。研究利用植物精油作为化学杀菌剂的替代品用于防治植物病虫害已成为国内外的研究热点[6,17]。国外已经开发出几种精油类农药，并被美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)认证为一般公认安全(generally recognized as safe，GRAS)。例如，Mycotech公司以肉桂油为原料，以其主要成分肉桂醛为有效成分研制出30%的乳油产品，用作杀虫、杀螨、杀菌剂。EcoSMART公司推出用于防治植物病虫害的气雾剂和粉剂产品，不同产品包含肉桂、百里香、丁香、迷迭香、薄荷油以及2-苯乙基丙酸酯等活性成分。国内也逐渐开始重视对植物精油的研究和应用。植物精油作为一种新型的植物源农药，相较于传统化学药剂，其对人类和环境的风险更小，具有潜在的价值和广阔的市场。

二氧化氯是目前国际上公认的一种安全高效的杀菌剂，被联合国卫生组织(WHO)列为A1级安全消毒剂，具有无毒、无害、无残留的特点[18]。国外发达国家已广泛将其应用于环境杀菌消毒、食品行业、果蔬保鲜以及水质净化等方面，并颁布了相应的法令和法规[19]。近年来，我国也出台了关于二氧化氯在各行业使用的相关标准，并大力推广应用。二氧化氯作为消毒剂也逐步应用于蚕桑产业，黄旭华等[20]将二氧化氯应用于桑叶表面消毒并取得良好效果。

脂肪酸及其部分衍生物天然存在于许多动植物体内，因此天然脂肪酸及其部分衍生物在小剂量下一般无毒无害，也不会对环境产生任何污染，大部分脂肪酸被美国FDA认证为GRAS。国外对脂肪酸及其衍生物的抑菌作用研究较早，已广泛应用于食品、化妆品、医药、农药等领域[21-22]。

随着社会的发展，人们越来越关注食品健康和环境安全问题。逐步淘汰高毒、高风险的农药，开发绿色高效的替代产品将成为农业未来的发展方向。本研究选择了10种绿色药剂开展桑椹菌核病的防治试验，结果表明，在田间环境下，香芹酚和二氧化氯对桑椹菌核病没有防治效果，而脂肪酸对桑椹菌核病的相对防治效果仅为4.08%～46.93%。由此说明，这些新型绿色防控药剂比传统化学药剂相对安全，但尚未达到理想的防效。因此，如何提高新型绿色药物的防效还有待进一步研究。当前，对桑椹菌核病的防控重点是围绕病害的发生规律采取措施，除了通过药物杀灭病原菌外，还可从切断其传播途径以及控制环境等方面入手，通过多种手段协同控制桑椹菌核病的发生和减轻危害。