在线前衍生化-高效液相色谱法检测沧州金丝小枣中的氨基酸

刘宪军 王晓明 来创业 王猛 刘本发

摘 要：本文建立了在线前衍生化-高效液相色谱法检测沧州金丝小枣中的氨基酸。对氨基酸的萃取条件进行了优化，确定最终萃取条件：提取的溶剂为0.1 moL/L的HCl;提取的时间为50 min;提取的温度为80 ℃;采用200 mm×2.1 mm的AA色谱柱和保护柱，以20 mmoL醋酸钠溶液+0.018%TEA为流动相A，20%的20 mmoL醋酸钠溶液（用1%～2%醋酸调pH值至7.2）+40%乙腈+40%甲醇为流动相B;柱流速定为0.45 mL/min。该方法的检出限为1.0～2.0 mg/kg;平均加标回收率为80.0%～103.0%;相对标准偏差为6.2%～11.1%。该方法的重现性较好、灵敏度高，可用于沧州金丝小枣中氨基酸的检测。

关键词：在线前衍生化-高效液相色谱法;沧州金丝小枣;氨基酸

Abstract： In this paper， an online pre-derivatization-high performance liquid chromatography method was established for the determination of amino acids in Cangzhou jujube. The extraction conditions of amino acids were optimized， and the final extraction conditions were determined to be the extraction solvent of 0.1 moL/L HCl; the extraction time was 50 min; the extraction temperature was 80 ℃; a 200 mm×2.1 mm AA column and Guard column， use mobile phase A as 20 mmol sodium acetate solution + 0.018% TEA， adjust pH to 7.2 with 1%～2% acetic acid and 20 mmol sodium acetate solution of 20% mobile phase （adjust pH to 7.2 with 1%～2% acetic acid） +40 % acetonitrile +40% methanol was used as the mobile phase; the column flow rate was set at 0.45 mL/min. The detection limit of the method was 1.0～2.0 mg/kg; the average recovery was 80.0%～103.0%; the relative standard deviation was 6.2%～11.1%. The method has good reproducibility and high sensitivity， and can be used for the detection of amino acids in Cangzhou jujube.

Keywords： pre-online derivatization-high performance liquid chromatography; Cangzhou golden silk jujube; amino acid

沧州金丝小枣又名西河红枣，因干枣剥开时有金黄丝相连，入口甜如蜜，外形如珠似玑，故称金丝小枣。沧州金丝小枣被视为良好的滋补品，具有益心润肺、合脾健胃、益气生津、补血养颜之功效。目前用于氨基酸分析检测的方法主要有茚三酮比色法、氨基酸自动分析仪法、气相色谱法、毛细管电泳法、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等[1-8]。本文建立了在线前衍生化 - 高效液相色谱法检测沧州金丝小枣中的氨基酸，以期为相关研究提供参考。

1 材料与试剂

1.1 仪器与试剂

试验中使用的仪器与试剂见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：200 mm×2.1mm AA柱和保护柱;流动相：A=20 mmol 醋酸钠+0.018% TEA，用1%～2%醋酸调pH值至7.2，B=20%的20 mmoL醋酸钠（用1%～2%醋酸调pH值至7.2）+40%乙腈和40%甲醇。

流速：0.45 mL/min;A 压缩性：5.0×10-3 kPa;B压缩性：1.15×10-2 kPa;冲程：A和B自动洗脱程序：梯度洗脱（100% A，17 min到40%A∶60%B，18 min到100% B，18.1 min时流速0.45 mL/min，18.5 min时流速0.8 mL/min，23.9 min时流速0.8 mL/min，24 min时100% B，流速0.45 mL/min，25 min时0% B）。

1.2.2 检测器（紫外检测器）設置条件

0 min时：信号A=338/10 nm，参考=390/20 nm;信号B=261/16 nm，参考=324/8 nm。

15 min时：信号A=262/16 nm，参考=324/8 nm;柱温：40 ℃;延迟时间：5 min。

1.2.3 进样器程序

10～14号瓶为1 mL进样瓶，分别装有硼酸缓冲液、OPA试剂、水、样品、FMOC。

进样器程序为：①从10号瓶中吸取5.0 μL硼酸缓冲液;②从11号瓶中吸取1.0 μL OPA试剂;③从12号瓶中吸取0.0 μL水;④从13号瓶中吸取样品;⑤从12号瓶中吸取0.0 μL水;⑥8 μL原位混合，最大速度，6次;⑦从14号瓶中吸取1.0 μL FMOC;⑧从12号瓶中吸取0.0 μL 水;⑨9 μL原位混合，最大速度，3次;⑩进样。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择及优化

选择了3种提取溶剂进行试验，其中包括纯水、一定浓度HCl溶液和NaOH溶液。本试验采取了两种提取方式：80 ℃水浴提取法、超声波萃取仪提取法。对几个处理的条件进行反复试验和优化，包括提取方式的选择（80 ℃水浴提取法和超声提取法）、提取试剂的选择（纯水、HCl溶液和NaOH溶液）和提取持续的时间等。本文在进行上述的各种前处理条件的比较选择时，是根据比较被测的沧州金丝小枣样品中氨基酸的各组分在仪器中的响应值的大小。

2.1.1 提取方式的选择

水浴提取法的试验条件为称取2 g枣粉，放入250 mL带塞锥形瓶中，加入50 mL的纯水，在80 ℃的水浴的条件下反复浸提30 min，提取完毕后，进行冷冻离心，取上清部分，过0.45 μm的水相微孔滤膜;超声提取法的试验条件为称取2 g枣粉，放入250 mL有塞的锥形瓶中，加入50 mL的纯水，超声提取30 min，提取完毕后，进行冷冻离心，取上清部分，过0.45 μm的水相微孔滤膜，每种提取方式做了6个平行样品，进行数值比较，发现水浴提取法效果好，因此选择了水浴提取法的方式。

2.1.2 提取溶剂的选择

选择了3种提取溶剂进行了试验，其中包括纯水、0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH 3种溶剂。在试验结果中，使用0.1 mol/L浓度的HCl所提取出的氨基酸总量明显高于纯水和0.1 mol/L浓度的NaOH，通过比较发现，0.1 mol/L浓度的HCl作为提取溶剂所提取出的氨基酸种类是最多的，选择0.1 mol/L浓度的HCl作为提取溶剂。

2.1.3 提取温度的确定

选择50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃ 5个温度进行比较试验。每一种水浴设置温度平行处理6个样品，检测最后得出峰面积的平均值。通过计算检测出的氨基酸的色谱峰平均面积，确定试验中水浴的设置温度，选择80 ℃作为试验水浴的提取设置温度。

2.1.4 提取时间的确定

选择5个提取时间进行梯度比较，分别为：30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，通过比较分析色谱峰总面积，确定提取的时间。每个提取温度做了6个平样，取平均峰面积总和进行比较。在提取时间为60 min时，氨基酸提取的总量达到最大值，选择50 min为水浴的提取时间。

2.2 标准曲线、相关系数和检出限

配制系列标准液（1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50.0 μg/L及100.0 μg/mL），在1.2.1色谱的条件下对17种氨基酸标准品进行检测。色谱图见图1。根据各组分的浓度（X，μg/mL）与对应的峰面积（Y）的关系，求得线性回归方程，见表2。回归分析表明，试验具有良好的线性关系，回归系数r>0.999 4。

2.3 方法的回收率与精密度

添加浓度进行试验，试验重复7次（n=7），回收率的测算是在样品中加入不同浓度的氨基酸混合标准溶液，使用外标法定量，方法的精密度和回收率见表3。

3 结论

本文建立了在线衍生化-高效液相色谱法测定沧州金丝小枣中的氨基酸。对萃取条件进行了优化，确定最终萃取条件为提取溶剂：0.1 moL/L的HCl;提取时间50 min;提取温度80 ℃;采用200 mm×2.1mm AA柱和保护柱，以20 mmoL醋酸钠+0.018%TEA溶液（用1%～2%醋酸调pH至7.2）为流动相A，以20%的20 mmoL醋酸钠溶液（用1%～2%醋酸调pH值至7.2）+40%乙腈+40%甲醇为流动相B;流速为0.45 mL/min;方法检出限为1.0～2.0 mg/kg，平均加标回收率为80.0%～103.0%，相对标准偏差为6.2%～11.1%。该方法重现性好、灵敏度高，可用于沧州金丝小枣中氨基酸的检测。

参考文献

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