BnaYUCCA10 基因在不同油酸含量油菜中的表达

郭诗芬，钟婷婷，卢文斌，刘忠松，邬贤梦,2，官春云，肖钢,2*

(1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

高油酸菜籽油具有营养价值高、稳定性强、保质期长等优点[1–2]。目前对油菜油酸相关基因的研究大多集中于对脂肪酸去饱和酶(FADs)基因家族的研究[3–5]，而对脂肪酸代谢调控途径中其他基因的研究较少。黄素单加氧酶(YUCCA)家族是植物生长素依赖色氨酸合成途径的关键限速酶[6]，这些酶可催化丙酮酸丙酮酯直接转化为吲哚–3–乙酸(IAA) ， 而 吲 哚–3– 丙 酮 酸 单 氧 合 酶 基 因(BnaYUCCA10)是生长素IAA 生物合成途径中的限速酶基因。在发育中的油菜籽粒中，IAA 含量受该基因影响较大。目前，已在拟南芥[7–8]、水稻[9]、玉米[10]和番茄[11]中成功克隆了BnaYUCCA10同源基因，该基因在不同类型植物的生长和发育中具有相似的作用。笔者曾对2 组不同油酸含量的甘蓝型近等基因系油菜进行miRNA 测序，结果(待发表)表明，与生长素合成相关的靶基因BnaYUCCA10在该近等基因系中的表达差异显著。本研究中，以不同油酸含量的甘蓝型油菜为对象，分析BnaYUCCA10基因在不同油酸含量材料中的表达情况，并对BnaYUCCA10基因是否参与油酸的代谢进行分析，旨在发现新的与油酸代谢相关的基因，为研究甘蓝型油菜油酸代谢的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以30 份甘蓝型油菜为材料，使用安捷伦7890B气相色谱仪测定其油酸含量，结果见表1。材料1～20 号为甘蓝型高油酸材料，21～30 号为甘蓝型非高油酸材料，均由水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室提供。

表1 30 份甘蓝型油菜材料的油酸含量Table 1 Fatty acid contents in 30 rape seeds %

1.2 方法

1.2.1 取样

试验于2018 年9 月至2019 年5 月在湖南农业大学耘园基地进行。2018 年9 月30 日播种，2019年5 月1 日收获，按大田管理方式进行管理。每个小区面积10 m2，种植密度12 万株/hm2。3 次重复。在油菜的营养生长期、花期和角果期进行取样。营养生长期分别于油菜幼苗期、5～6 叶期和蕾薹期取第1 片新叶；花期取花蕾中子房、开花1 d 的子房和开花5 d 的子房；角果期取开花15 d、开花25 d和开花35 d 的种子。以上材料各取5 株，混合保存于–80 ℃冰箱内，备用。

1.2.2 RNA 提取

采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans Gene Biotech)提取总RNA；采用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000 检测RNA 质量与浓度。

1.2.3BnaYUCCA10基因的表达量分析

运用Primer Premier 6.0 设计RT–PCR 引物(表2)，以BnaUBC9作为内参基因[12]，参照PFAFFL[13]的方法，使用Bio–Rad CFX96 荧光定量PCR 仪测定BnaYUCCA10基因的表达量。3 次重复，结果取平均值。

表2 荧光定量引物序列Table 2 Primer for RT-PCR

1.2.4 数据处理

采用SPSS 进行数据分析；运用Excel 2010 绘图。

2 结果与分析

2.1 BnaYUCCA10 基因在营养生长期的表达

营养生长期BnaYUCCA10基因在30 份甘蓝型油菜中的表达情况见图1。从图1 可以看出，除7、13、14、15、16 号材料外，其他材料幼苗期、5～6叶期、蕾薹期BnaYUCCA10的表达量呈逐渐增加的趋势；营养生长期高油酸材料和非高油酸材料的表达量无显著差异。

图1 营养生长期BnaYUCCA10 基因的相对表达量Fig.1 Expression level of the BnaYUCCA10 gene during vegetative growth

2.2 BnaYUCCA10 基因在花期的表达

花期BnaYUCCA10基因在30 份甘蓝型油菜中的表达情况见图2。从图2 可以看出，除2、6、9、10、17 号材料外，其他材料1 d 的花中BnaYUCCA10基因的表达量均高于花蕾和5 d 的花中的表达量；花蕾和5 d 的花中高油酸材料的BnaYUCCA10基因表达量高于非高油酸材料的表达量，1 d 的花中高油酸材料的表达量低于非高油酸材料的表达量。

图2 开花期BnaYUCCA10 基因的相对表达量Fig.2 Expression level of the BnaYUCCA10 gene during the flowering period

2.3 BnaYUCCA10 基因在角果期的表达

BnaYUCCA10基因在30 份甘蓝型油菜角果期的表达情况见图3。从图3 可以看出，除14、15 号材料外，其他材料15 d 的种子、25 d 的种子、35 d的种子BnaYUCCA10的表达量均呈现逐渐下降的趋势；15 d 的种子中的BnaYUCCA10基因表达量是25 d 的种子中的1.1～2.4 倍，是35 d 的种子中的1.3～3.9 倍；角果期高油酸材料的BnaYUCCA10表达量高于非高油酸材料的表达量。

图3 角果期BnaYUCCA10 基因的相对表达量Fig.3 Expression level of the BnaYUCCA10 gene during the silique period

2.4 BnaYUCCA10基因表达水平与油酸含量之间的相关性分析

对30 个油菜品系的BnaYUCCA10基因在整个生育时期的表达量与油酸含量进行线性及非线性相关性分析。结果(表3)表明：营养生长期的叶片及花期的花蕾、1 d 的花中的表达量与油酸含量均无显著相关性；而角果期的种子及5 d 的花中基因表达量与油酸含量间均呈极显著正相关。

表3 BnaYUCCA10 基因表达量与种子油酸含量的相关性Table 3 Correlation a nalysis between BnaYUCCA10 gene expression and seed oleic acid content

3 结论与讨论

前人研究结果表明，油菜发育早期一些基因的表达量可用于预测油菜的生长[14]。王晓丹等[15]分析了BnaHSP90和BnaATG3基因在油菜发育早期的表达与油菜抗病性的相关性。常涛等[16]发现BnDGAT1和BnPDAT1基因的表达与油菜种子成熟后的含油量呈显著正相关。本研究中，生长素合成的关键基因BnaYUCCA10在高油酸材料中的表达量高于非高油酸材料的，且在5 d 的花和角果期中的表达量与种子油酸含量呈极显著正相关，这与笔者前期进行的miRNA 测序结果一致，表明BnaYUCCA10基因的表达水平可用于预测油菜籽的油酸含量。

BnaFAD2是影响油酸积累的关键基因。刘睿洋等[17]克隆了油菜籽中BnaFAD2基因并分析了其功能和结构。熊兴华等[18]采用基因枪法将BnFAD2基因导入甘蓝型油菜中，为高油酸油菜育种提供了基础材料。刘芳等[19]同时干扰了油菜中的BnFAD2、BnFAD和BnFATB基因，使油酸含量从66.76%增至82.98%。PENG 等[4]同时沉默BnaFAD2和脂肪酸延伸酶1 基因(FAE1)，获得了油酸含量大于85%的转基因品系。然而，仅抑制BnaFAD2基因很难获得油酸含量大于85%的油菜籽。本研究结果表明，BnaYUCCA10基因的表达量在角果期与油酸含量呈极显著正相关，与主效基因BnaFAD2的作用相反，可以初步确定该基因与FAD2基因均为影响油酸含量的基因。BnaYUCCA10基因作为潜在促进油酸合成的基因，将有助于高油酸油菜分子机理的研究。

YUCCA基因家族编码的黄素单加氧酶是生长素合成过程中色氨酸依赖途径中的1 个限速酶，在植物生长发育过程中发挥着重要的作用[20]。杨芳慧等[21]发现茶树CsYUCCA10的表达量随着花的生长发育呈增加趋势。李娜[22]研究发现，TaYUC基因在小麦中的表达具有时空特异性，在生殖器官(花和种子)中强烈表达。本研究结果发现，营养生长期大部分材料中BnaYUCCA10基因表达量随生育进程逐渐增加；花期1 d 的花中BnaYUCCA10的表达量高于花蕾和5 d 的花的表达量；角果期BnaYUCCA10基因的表达水平逐渐降低，表明BnaYUCCA10基因可能在油菜的生长发育过程中起到关键的调控作用，可为今后油菜生长发育调控及YUCCA基因的研究提供参考。