高温干旱胁迫下水稻花器官中敏感基因的筛选

彭艳，刘跃武，刘伯涵，陈信波

（1.作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学信息与智能科学技术学院，湖南 长沙410128；3.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128）

高温是限制植物生长和产量的关键因素之一[1]，而通常称为“伴生胁迫”的高温干旱复合胁迫在热带和亚热带的水稻主要种植区非常普遍。有研究[2-4]表明，在复合胁迫条件下观察到的生理和分子水平反应与单独暴露于任何一种胁迫下的反应有较大的差异。生殖期（特别是开花期）被认为是对高温和干旱胁迫最敏感的时期[5]。开花期高温会使水稻花期变短，花时分散，柱头上花粉的粒数、花粉萌发率、花粉活力、花药开裂系数以及结实率显著下降，进而影响产量[6-9]。而开花期高温干旱复合胁迫能诱导花药异常开裂，导致柱头上萌发的花粉数量减少、育性下降，且胁迫持续的时间越长，育性越低，最终影响产量和品质[5,10]。

植物miRNAs 是一类由内源基因编码的大小约20～24 nt 的非编码单链小分子RNA，通过与mRNA 3'-UTR 互补结合，导致mRNA 降解或翻译抑制来调控基因的表达[11]。近年来，随着分子生物学的发展，有学者发现许多水稻miRNAs 在逆境胁迫中发挥着重要的作用。在高温胁迫下，过表达miR169R-5P 能通过调节靶基因OsHAP2F的表达来增强水稻开花期的耐热性[12]。本研究中，笔者拟通过数据库检索和文献挖掘，对高温胁迫和高温干旱复合胁迫下水稻（N22）花药和授粉雌蕊的转录组数据进行分析，旨在探寻在高温和高温干旱复合胁迫下花药和授粉雌蕊中均差异表达的敏感基因，通过分析其表达模式、染色体分布以及所富集的功能和参与的代谢途径，预测这些敏感基因可能受哪些上游miRNAs 的调控，为水稻抗性新品种选育提供潜在的分子标记，同时也为完善miRNAs 及关键基因在伴生胁迫下的调控机制提供依据。

1 数据来源与分析方法

1.1 数据来源

高温和高温干旱复合胁迫下水稻N22 的花药和授粉雌蕊中基因表达谱数据来自NCBI 数据库生物数据集GSE57154[13]和文献[14]。在生物数据集GSE57154 中一共选取了3 个处理的14 个样本。对照处理包括 3 个正常生长的水稻花药样本GSM1376277、GSM1376278、GSM1376279 和3 个正常生长的水稻授粉雌蕊样本 GSM1376301、GSM1376302、GSM1376303，生长在自然光照条件下，相对湿度75%～85%，昼、夜温度分别为29、21 ℃。高温处理包括3 个受高温胁迫的水稻花药样本GSM1376295、GSM1376296 和GSM1376297, 其处理条件为：昼、夜温度分别设置为38、21 ℃，相对湿度为75%，07:30—08:30 从29 ℃逐渐升高至38 ℃，并保持在38 ℃直至14:30。高温干旱复合胁迫处理包括3 个受高温干旱复合胁迫的水稻花药样本GSM1376289、GSM1376290、GSM1376291 和2个高温干旱复合胁迫的水稻授粉雌蕊样本GSM1376307、GSM1376308。高温干旱复合胁迫条件为：干旱胁迫从主蘖抽穗前5 d 开始，当水稻开花期剑叶相对含水率保持在60%～70%时，38 ℃下热处理6 h（08:30—14:30）。从文献[14]中收集高温胁迫下水稻授粉雌蕊中基因表达谱数据。其对照和高温处理的条件与生物数据集GSE57154 的条件一致。

高温胁迫下响应的水稻miRNAs 表达数据来自文献[15-16]；干旱胁迫下响应的miRNAs 表达数据来自文献[17-18]；高温干旱复合胁迫响应的miRNAs 表达数据来自文献[19]。

1.2 分析方法

1.2.1 差异表达分析

采用GEO2R 对高温和高温干旱复合胁迫下水稻花药和授粉雌蕊的转录组数据进行差异表达分析，通过比较花药和授粉雌蕊中对照组数据和胁迫处理数据来筛选差异表达的基因。筛选的准则如下：

式中：FC（fold change）为倍数变化，FDR（false discovery rate） 为错误发现率。同时满足公式（1）和（2）的基因即为差异表达基因（DEGs）。在高温和高温干旱复合胁迫下的花药和授粉雌蕊中均差异表达的基因即视为敏感基因。

为了鉴定高温、干旱和高温干旱复合胁迫下水稻中差异表达miRNAs（DE-miRNAs），通过比较对照组数据和胁迫处理数据来筛选具有差异表达的miRNAs，满足公式（1），则视为高温、干旱和高温干旱复合胁迫下的DE-miRNAs。

1.2.2 基因的功能分类和富集分析

利用生物信息学工具STRING v11.0[20]进行蛋白结构域、GO 功能、UP_KEYWORDS 以及RCTM通路的富集分析。选取满足公式（2）的注释和通路用于进一步分析。

1.2.3 敏感基因上游miRNAs 的预测与高信度miRNAs 的鉴定

利用植物 miRNAs 靶基因在线预测软件psRNATarget[21]对敏感基因的上游miRNAs 进行预测。所有参数除将最大期望值设置为3 外，其他均按照软件所述设置严格的筛选标准，敏感基因的DNA 序列从RAP-DB（https://rapdb.dna.affrc. go.jp/）数据库中获取，miRNAs 数据库选择 miRBase Release 21 进行匹配。

获得预测的miRNAs 后，将其与在高温、干旱或高温干旱复合胁迫下水稻中的DE-miRNAs 数据进行比较，得到预测的miRNAs 在干旱、高温、高温干旱复合胁迫下的差异表达数据，这些差异表达的预测miRNAs 即有可能是高温和高温干旱复合胁迫下水稻花药和授粉雌蕊中敏感基因的高信度miRNAs。

1.2.4 维恩分析

通过在线工具“An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams” venny 2.1（https://bioinfog p.cnb.csic.es/tools/venny/）编制Venn 图。

2 结果与分析

2.1 高温和高温干旱复合胁迫下水稻花药和授粉雌蕊中DEGs 的鉴定与分析

高温胁迫下，共有1153 个基因在花药中差异表达，其中186 个上调，967 个下调；630 个基因在授粉雌蕊中差异表达，其中上调的259 个，下调的371 个。高温干旱复合胁迫下，在花药中共鉴定出1484 个基因差异表达，其中表达上调的基因1185 个，下调的299 个；2672 个基因在授粉雌蕊中差异表达，其中上调的1381 个，下调的1291 个。这些结果表明，无论是在花药还是授粉雌蕊中，高温干旱复合胁迫下DEGs 的数量均明显高于单一的高温胁迫；高温胁迫下在花药和授粉雌蕊中表达上调的基因数量明显低于下调基因的数量，而高温干旱复合胁迫下的结果却刚好相反，上调的基因数明显高于下调的基因数。说明无论是花药还是授粉雌蕊都主要是通过下调基因的表达来抵御高温胁迫，通过上调基因的表达来抵御高温干旱复合胁迫。

高温和高温干旱复合胁迫下花药和授粉雌蕊中DEGs 的分布见图1。结果显示，共有304 个基因在高温胁迫和高温干旱复合胁迫下的花药中差异表达；在授粉雌蕊中，有293 个基因既在高温胁迫下差异表达，又在高温干旱复合胁迫下差异表达；高温胁迫下，在花药和授粉雌蕊中均差异表达的基因有95 个；在高温干旱复合胁迫下，有380个基因在花药和授粉雌蕊中差异表达。但仅有47个基因在高温胁迫和高温干旱复合胁迫下的花药和授粉雌蕊中均差异表达，说明这47 个差异表达的基因在胁迫下的水稻花药和授粉雌蕊中起着非常重要的作用，是胁迫下花器官中的敏感基因。

图1 高温和高温干旱复合胁迫下水稻花药和授粉雌蕊中DEGs 的韦恩图Fig. 1 The Venn diagram analysis on the DEGs in rice anthers and p ollinated p istils under he at s tress and c ombined heat and drought stress

2.2 47 个敏感基因的表达分析及染色体分布

高温和高温干旱复合胁迫下水稻花药和授粉雌蕊中的47 个敏感基因的表达及注释见表1。从表1 可以看出，这47 个敏感基因主要由热激蛋白、伴侣蛋白、钙结合蛋白和折叠酶等基因家族组成，其中，2 个类钙调蛋白基因CML36在高温和高温干旱复合胁迫下的花药中表达上调，但在授粉雌蕊中表达下调，表明这2 个敏感基因在逆境胁迫下的表达具有组织特异性，但对不同种类胁迫的应答没有特异性；OMTN4在高温胁迫下表达下调，但在高温干旱复合胁迫下表达上调，说明OMTN4在逆境胁迫下的表达具有胁迫特异性；RS5仅在高温胁迫下的花药中表达下调，在授粉雌蕊中及高温干旱复合胁迫下的花器官中表达均上调；其余43 个敏感基因在高温和高温干旱复合胁迫下的水稻花药和授粉雌蕊中表达一致，除PSD2和UMAMIT7表达下调外，其他41 个敏感基因（包括热激蛋白、伴侣蛋白、折叠酶、糖转运蛋白基因等）均上调其表达。染色体分布分析发现，47 个敏感基因在除10 号染色体外的其他染色体上都有分布，但在1～6 号染色体具有较高的靶向频率。

表1(续)

2.3 47 个敏感基因所富集的蛋白结构域

47 个敏感基因的INTERPRO 蛋白结构域的富集分析结果表明，敏感基因主要富集到25 个蛋白质结构域（图2），主要为热休克蛋白（包括4个HSP70和13 个小热休克蛋白）、伴侣蛋白（主要是ClpB 和DnaJ）、四肽重复、FKBP 型肽脯氨酰顺反异构酶和EF-hand 蛋白结构域。而类HSP20 伴侣、小热休克蛋白HSP20 和α 晶体蛋白/Hsp20 结构域是富集基因数量较多的结构域，所富集基因数分别为14、13和13。

图2 47 个敏感基因的蛋白质结构域富集分析结果Fig.2 INTERPRO protein domains enrichment analysis result of 47 sensitive genes

2.4 47 个敏感基因的功能富集分析

47 个敏感基因的功能富集分析结果（图3） 表明，敏感基因主要富集到16 个GO 术语，包括9个生物学过程（biological process，BP）和7 个细胞组分（cellular component，CC），没有显著富集的分子功能。生物学过程主要富集在对热响应、对压力的反应以及对活性氧的反应等与胁迫密切相关的过程以及蛋白质折叠；细胞组分主要富集于细胞质、胞内和胞质部分。在RCTM 途径富集分析中发现，47 个敏感基因主要富集于8 条代谢途径，其中细胞对压力的反应、类固醇激素受体的HSP90 伴侣循环以及细胞对热应激的反应是排在前3 位显著富集的途径，且细胞对压力的反应途径所富集的基因最多（6 个）。此外，敏感基因还显著富集于HSF1 依赖性转录激活、HSF1 介导的热休克反应调控、蛋白质甲基化、粒作用和翻译后蛋白质修饰等基本的生物代谢途径和热激响应途径。UP_KEYWORDS 分析共获得了12 个显著富集的UP_KEYWORDS 术语，其中应激反应、细胞质和内质网是排在前3 位的显著富集的UP_KEYWORDS 术语；富集基因数最多的是应激反应和螺旋线圈，分别有17、10 个基因，此外，敏感基因还显著富集于钙、ATP 结合、选择性拼接、重复、轮状淀粉酶、异构酶、分子伴侣、内质网和TPR 重复。综合以上情况可知，47 个敏感基因在高温和高温干旱复合胁迫下的花药和授粉雌蕊中主要参与了一些基本的以及与胁迫密切相关的生物学过程和代谢途径，还参与了蛋白质甲基化和类固醇激素受体的HSP90 伴侣循环。

图3 47 个敏感基因的功能富集分析结果Fig.3 The functional enrichment analysis result of 47 sensitive genes

2.5 高温、干旱和高温干旱复合胁迫下 DEmiRNAs 鉴定以及47 个敏感基因的上游miRNAs 预测

通过文献检索和差异表达分析，分别鉴定出154、339、22 个在高温、干旱和高温干旱复合胁迫下差异表达的水稻miRNAs。对47 个敏感基因的上游miRNAs 进行预测，获得了49 个潜在的miRNAs。将49 个潜在的miRNAs 与表1 中差异表达的miRNAs 进行对比，发现49 个潜在的miRNAs 中有28个miRNAs在干旱或高温或高温干旱复合胁迫下差异表达，说明这28 个差异表达的miRNAs 可能是其对应的13 个敏感基因的潜在上游miRNAs（表2）。已有研究证实LOC_Os06g46270 （OMTN4）是osa-miR164 的靶基因[20]，说明通过敏感基因的DNA 序列可预测其可能受哪些miRNAs 的调控。

表2 敏感基因的miRNAs 预测Table 2 The putative miRNAs of sensitive genes

3 结论与讨论

本研究采用生物信息学手段，从水稻花器官转录组数据中筛选出47 个在高温胁迫和高温干旱复合胁迫下的花药和授粉雌蕊中均差异表达的敏感基因，并对其表达模式、所富集的蛋白结构域、功能和代谢途径以及可能受哪些上游miRNAs 的调控进行了分析。结果表明：热休克蛋白、伴侣蛋白以及折叠酶的表达上调，将有利于水稻花器官对抗胁迫诱导的胞内蛋白损伤，增强水稻抗性。因为热休克蛋白和分子伴侣是逆境胁迫应答的主要功能蛋白[22]，热休克蛋白能利用其分子伴侶的活性促进变性蛋白正确的重折叠来防止蛋白的沉淀，从而使得细胞能对抗高温诱导的胞内蛋白的损伤；而折叠酶如蛋白质二硫键异构酶（PDIs）在植物氧化还原信号转导和蛋白质折叠中起重要作用。有研究[23-25]发现，拟南芥中的PDIs在花中的表达量较高，且逆境胁迫能诱导PDI表达的迅速上升，以抵御胁迫，增强植物的抗性。高温干旱复合胁迫下，谷类作物花中热休克蛋白和糖转运与积累的调节是决定不同基因型品种耐逆性的关键因素[26]，糖转运蛋白在糖的运输和积累中起重要作用。本研究中，糖转运蛋白基因UTR3在2 种胁迫下的表达上调，说明其可能是逆境胁迫下提高水稻抗性的关键基因。UMAMIT7作为生长素诱导蛋白基因，在水稻不同发育阶段各器官的转录组分析中发现其在灌浆籽粒、花和花蕾中的表达量最高[27]。本研究中，UMAMIT7在2 种胁迫下的花药和授粉雌蕊中的表达下调，说明其可能不利于水稻开花和灌浆。在胁迫条件下具有组织特异性的类钙调蛋白CML 可能对生殖期水稻育性起关键作用。有研究[28-29]表明，类钙调蛋白CML 在调控花粉发育、花粉管生长以及逆境胁迫方面起重要作用，但在2 种逆境胁迫下对水稻花药和授粉雌蕊的影响还有待进一步研究。有研究[30-31]表明，OMTN4在高温胁迫和干旱胁迫下的表达水平均会显著降低，而过表达OMTN4会降低水稻生殖期的抗旱性。本研究中，OMTN4在高温胁迫下表达下调，但在高温干旱复合胁迫下的表达水平显著提高，说明OMTN4可能在高温干旱复合胁迫下产生了不同于单独暴露在高温或干旱胁迫下的表达模式，不利于水稻生殖期的耐逆性。

富集分析结果显示，47 个敏感基因主要富集于与胁迫相关的蛋白结构域、生物学过程以及代谢途径。富集的小热休克蛋白（sHSP）是植物抗逆过程中的第一条防线[32]，而HSP70 蛋白可增强植物对多种非生物逆境胁迫的抗性[33]，还可通过调节活性氧的含量来抑制水稻细胞的程序性死亡[34]。作为HSP100 和HSP70 分子伴侣家族成员的ClpB 和DnaJ 在对抗高温胁迫等多种逆境过程中起着非常重要的作用[35-36]。EF-hand 结构域是一种与Ca2+结合有关的螺旋-环-螺旋结构，这种结构能通过与Ca2+的快速结合或分离，增强植物对非生物胁迫的耐受性[37]。四肽重复与伴侣蛋白有特定的相互作用，且与水稻抗性有关[38]。FKBP 型肽脯氨酰顺反异构酶在胁迫反应中也起着重要作用[39]。说明高温胁迫和高温干旱复合胁迫下花药和授粉雌蕊中绝大多数敏感基因的功能都与抗逆相关，这为进一步深入研究高温干旱胁迫下水稻花器官中关键响应基因的生理功能提供依据。

miRNAs 的生物学功能与其靶基因的功能密切相关。miRNAs 可通过调节靶基因的表达在植物生长发育、激素响应和抗逆等多个方面起至关重要的作用。由于植物miRNA 对靶基因的识别具有高度保守性，一般不会超过4 个碱基的错配，这为通过逆向思维获得敏感基因可能的上游miRNAs 提供了可能。结合敏感基因表达分析、富集分析以及上游miRNAs 的预测结果，可推断2 种胁迫条件下，osa-miR5144-3p、osa-miR2878-3p、osa-miR1848、osa-miR1862e/f/g、osa-miR529b 和osa-miR5498 可能在水稻花器官防止蛋白沉淀、促进蛋白正确折叠中起重要的作用；而osa-miR164、osa-miR156 和osa-miR5162 则可能在水稻生殖期间对水稻育性、抽穗、衰老以及磷脂代谢中起关键作用，但这些miRNAs 对水稻花器官的具体影响还有待进一步验证。