精氨酸代谢酶ASS1/CAT1与结肠癌相关性研究

向鹏程， 屈少华， 韩俊毅

(同济大学附属东方医院胃肠外科，上海 200120)

结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]。近年来对肿瘤微环境免疫细胞、结肠癌细胞的氨基酸代谢以及表观遗传学调控开展研究，发现结肠癌细胞有着异常的精氨酸代谢以及表观遗传学调控。先前研究发现，精氨酸代谢异常与结肠癌的发生发展密切相关[2]。在结肠癌患者血清中，精氨酸终端代谢物多胺水平升高，L-精氨酸水平降低，而且在癌组织中L-精氨酸以及L-瓜氨酸浓度较邻近正常组织明显蓄积增高，提示L-精氨酸在大肠癌组织中的生物利用度增高[3]。外源性的精氨酸通过阳离子氨基酸转运蛋白(cationic amino acid transporters, CATs)，主要为阳离子氨基酸转运蛋白-1(cationic amino acid transporter 1, CAT1)进入细胞[4]。细胞内精氨酸代谢产物又可以通过先后通过精氨酸琥珀酸盐合成酶-1(argininosuccinate synthetase-1, ASS1)作用及一系列合成反应，通过中间产物再次合成精氨酸。但在结肠癌中，有关精氨酸代谢的两个关键酶ASS1、CAT1是否与结肠癌发生发展相关，并不清楚。故本文拟初步探究ASS1、CAT1在结肠癌中的表达情况及其与结肠癌临床病理的相关性。

1 资料与方法

1.1 组织标本

选取在2019年1月—2020年1月在同济大学附属东方医院手术的结肠癌患者手术标本，总计90例，癌组织标本取材自肿瘤中心部位，癌旁组织标本取材自距肿瘤边缘2 cm处正常组织。术后病理由病理科医师明确诊断，相关病理信息及病例资料如性别、年龄等从东方医院住院医师系统提取。

1.2 实验试剂

ASS1一抗及CAT1一抗来自赛默飞公司(上海)，徕卡免疫组化试剂盒(阻断剂+二抗+DAB显色剂)试剂盒来自德国徕卡公司。

1.3 实验方法

1.3.1 TCGA数据库分析 利用TCGA数据检索结肠癌病种，分别下载ASS1、CAT1相关的病例数据，分析在非配对样本中ASS1、CAT1在结肠癌癌组织及癌旁组织表达及其与结肠癌TNM分期的相关性。

1.3.2 组织芯片制备 对采集的组织标本进行梯度(70%、80%、90%、95%、100%)乙醇脱水，二甲苯浸泡透明，浸蜡。按照3.5 μm标准切片，每个蜡块切一张大切片，H-E染色备用。针对癌组织及癌旁组织进行定点标记，点芯直径大小为1.0 mm。从供体蜡块取芯，填充到受体蜡块并融合。按照4 μm规格阵列切片。放60 ℃烘箱烘烤0.5 h，二甲苯浸泡3次，每次10 min，无水乙醇浸泡3次，每次10 min，流水冲洗，芯片制作完成，备组织蛋白检测。

1.3.3 免疫组织化学实验 按常规进行免疫组化测定，分别滴加一抗(ASS1或CAT1)、LeicaIHC试剂盒二抗和Leica IHC试剂盒显色剂，中性树胶封片，显微镜下观察，组织芯片扫描仪扫描，量化评分。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 非配对样本结肠癌TCGA数据库分析

2.1.1 ASS1在结肠癌中的表达及其与TNM分期的相关性 从TCGA数据库中获取275例结肠癌组织及349例癌旁正常组织进行对比分析，癌组织中ASS1表达明显高于癌旁组织(P<0.05)，但结癌组织ASS1表达与TNM分期无关(P>0.05)，见图1。

图1 ASS1在结肠癌中的表达及其与TNM分期的相关性Fig.1 The expression of ASS1 in colon cancer and its correlation with TNM stagingA: 在275例结肠癌组织(T)及349例癌旁正常组织(N)中对比分析ASS1的表达差异，显示在结肠癌中ASS1的表达要明显高于癌旁组织；B: 分析ASS1的表达量在结肠癌各TNM分期中的差异，发现ASS1的表达于TNM分期无明显相关性,Ⅰ～Ⅳ分别指TNM临床病理分期Ⅰ～Ⅳ

2.1.2 CAT1在结肠癌中的表达及其与TNM分期的相关性 从TCGA数据库中获取275例结肠癌组织及349例癌旁正常组织进行对比分析，癌组织中CAT1的表达明显高于癌旁组织，并且癌组织中CAT1的表达与TNM分期存在相关性(P<0.05)，见图2。

图2 CAT1在结肠癌中的表达及其与TNM分期的相关性Fig.2 The expression of CAT1 in colon cancer and its correlation with TNM stagingA: 在275例结肠癌组织(T)及349例癌旁正常组织(N)中对比分析CAT1的表达差异，显示在结肠癌中CAT1的表达要明显高于癌旁组织；B: 分析CAT1的表达量在结肠癌各TNM分期中的差异，发现CAT1的表达于TNM分期无明显相关性,Ⅰ～Ⅳ分别指TNM临床病理分期Ⅰ～Ⅳ

2.2 配对样本结肠癌组织芯片分析

2.2.1 结肠癌ASS1的表达及与结肠癌病理、临床特征的相关性 将90例结肠癌病例的癌组织及癌旁组织构建组织芯片后，进行IHC染色。结果采用免疫组化评分(histochemistry score, H-Score)，排除染色不全及缺失的位点，得到共计(癌组织75、癌旁组织67)142个位点；癌组织及癌旁组织配对位点58对，见图3。其中142个位点中，ASS1均处于可检测水平。58对配对样本中，癌高于癌旁占46.6%(27/58)，癌低于癌旁占53.4%(31/58)。对58对配对位点H-Score评分进行配对样本t检验，结果提示，结肠癌、癌旁组织ASS1表达无差异，75例结肠癌组织芯片中ASS1表达与临床病理特征无关，但癌及癌旁组织ASS1表达量比值与淋巴结转移相关性(P<0.05)，见表1。

图3 结肠癌组织芯片中癌组织和癌旁组织ASS1表达Fig.3 Expression of ASS1 in cancerous tissue and paracancerous tissue in colon cancer tissue microarrayA: 在结肠癌组织中腺体明显异型增生，腺体结构混乱，ASS1染色呈阳性表达；B: 癌旁组织细胞形态正常，结构整齐，ASS1染色呈阳性表达

表1 结肠癌组织与癌旁组织ASS1表达比值与临床病例特征的相关性

2.2.2 结肠癌CAT1表达及与结肠癌病理、临床特征的相关性 将90例结肠癌病例的癌组织及癌旁组织构建组织芯片后，进行IHC染色以检测癌组织及癌旁组织CAT1的表达，结果用阳性率表示。排除染色不全及缺失的位点，得到共计(癌组织88、癌旁组织86)174个位点，癌组织及癌旁组织配对位点84对。其中癌组织有94.3%(83/88)表达CAT1，癌旁组织有78%(67/86)表达CAT1。84例配对样本中，癌高表达占63.1%(53/84)，癌低表达占36.9%(31/84)，见图4。对84对配对位点阳性率进行配对样本t检验结果显示，结肠癌、癌旁组织CAT1表达差异有统计学意义(P<0.05)，但88例结肠癌组织芯片CAT1表达与结肠癌临床病理特征无关。

图4 结肠癌组织芯片癌组织和癌旁组织中CAT1表达Fig.4 Expression of CAT1 in cancerous tissue and paracancerous tissue in colon cancer tissue microarrayA: 在结肠癌组织中腺体明显异型增生，腺体结构混乱，CAT1染色明显富集；B: 癌旁组织细胞形态正常，结构整齐，CAT1染色可见少量阳性表达，明显低于结肠癌组织

3 讨 论

研究表明，外源性的精氨酸主要通过CAT1进入细胞[4]。细胞内的精氨酸代谢产物瓜氨酸可以通过ASS1及精氨酸琥珀酸盐裂解酶(argininosuccinate lyase, ASL)作用及中间产物精氨酸琥珀酸盐，再次合成精氨酸，其中关键限速酶则是ASS1。由此可见，ASS1、CAT1在结肠癌中是否表达就显得尤为重要。

本文非配对样本结肠癌TCGA数据库分析提示，结肠癌组织ASS1表达明显高于癌旁组织，但组织芯片分析则两组无差异，这可能与TCGA数据库分析是非配对样本，而组织芯片是配对样本有关。事实上，有关结肠癌中ASS1的表达及其与结肠癌临床病理是否相关一直存在分歧。在一项超过600例的结肠癌组织芯片研究中，约18%的病例呈现ASS1的低表达，同时结肠癌细胞株中ASS1的表达也存在差异，SW480细胞持续表达ASS1，HCT116细胞中度表达ASS1，HT29和RKO细胞不表达ASS1[5]。另外一项关于结肠癌ASS1表达的研究中发现，ASS1是高表达的，并且表明抑制ASS1的表达会削弱结肠癌的致病性[6]。在细胞水平，不同细胞株间ASS1的表达呈现明显差异，这说明不同组织类型的结肠癌，ASS1的表达也存在较大差异，这也可能是造成上述不同结果的原因之一。结肠癌ASS1表达与TNM分期是否相关，报道也多有矛盾。有报道认为ASS1与结肠癌Dukes分期负相关[5]，但在另一篇报道中认为ASS1高表达与结直肠癌恶性进展相关[7]。本文结果表明，结肠癌ASS1表达与TNM分期无关；但结肠癌及癌旁组织比值与淋巴结转移相关，提示癌组织ASS1表达高于癌旁正常组织时更易出现淋巴转移，结肠癌及癌旁组织比值可能与患者预后相关。因此目前并不能完全明确ASS1与疾病进展的相关相关性，下一步需要扩大样本量，对不同组织类型，不同部位的结肠癌对比分析。

有研究报道，CAT1作为氨基酸的重要转运载体，其在结直肠癌组织中的表达是明显升高的[8]。并且在近期研究中，与CAT1相似的功能的精氨酸转运载体SLC6A14被发现在大肠癌中过表达，并且抑制其表达后能显著抑制大肠癌细胞的生长能力[9]。另有研究表明CAT1在人体内广泛表达，但在结直肠癌细胞是相对高表达的[10]。目前有关结直肠癌中CAT1高表达机制尚不清楚。考虑到在肝细胞癌中miRNA的异常高表达抑制了CAT1的表达[11]，因此在结直肠癌中，CAT1的高表达也可能与miRNA的调控相关。本研究非配对样本中CAT1在结肠癌表达明显高于癌旁，并与TNM分期相关；配对样本组织芯片分析亦表明，CAT1在癌组织中表达也明显高于癌旁组织，但CAT1在癌及癌旁组织中并非均呈阳性表达，部分组织有表达缺失情况。癌组织CAT1表达与结肠癌病理特征无相关性。鉴于TCGA的非配对分析还是组织芯片的配对分析均显示癌组织CAT1的表达是明显高于癌旁，因此推测结肠癌组织的外源性精氨酸摄入是亢进的。这与以往报道认为结肠癌精氨酸富集和细胞生长亢进与CAT1过表达有关的结论一致[8]。目前也鲜有有关CAT1与结肠癌进展相关性的报道，仅有1篇报道认为CAT1可能与结肠癌的手术后的肝转移相关[12]，因此有必要对CAT1与结肠癌预后相关性，进行深入探讨。