miRNA-195靶向调控CCND2和MYB抑制宫颈癌细胞增殖、迁移的机制研究

郝艳芳，刘亚荣，黄玲玲，张 源（河北北方学院附属第一医院妇科，河北张家口 075000）

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率位居女性肿瘤第二位，死亡率较高，据报道全世界每年约有30 万人死于宫颈癌，严重威胁女性生命健康[1-2]。近年研究表明，癌症的发生发展是一个受许多因素调节的极其复杂的多阶段过程，其中非编码微小RNA（miRNA）在包括宫颈癌在内的多种人类恶性肿瘤中异常表达，参与肿瘤的发生及恶性进展[3-4]。例如在宫颈癌中，miRNA29a 通过调节p16 甲基化来抑制细胞增殖和抑制细胞周期[5]。microRNA-106b 在宫颈癌组织中显著高表达，可促进肿瘤组织的发生、发展[6]。miRNA-211 通过下调抑制蛋白诱导宫颈癌SiHa 细胞凋亡[7]。microRNA-150 通过靶向RUNX2 使骨肉瘤对阿霉素诱导的细胞凋亡产生敏化作用[8]，为宫颈癌的研究治疗提供了新方向。miRNA-195 是位于人类17 号染色体的miRNA，最早被发现证实存在于小鼠肺组织中呈特异性高表达，此后在人类细胞组织中也发现了同源miRNA-195[9]。研究在肝癌、结直肠癌、非小细胞肺癌及宫颈癌等恶性肿瘤中也检测到miRNA-195表达下调，其扮演抑制基因参与调控肿瘤细胞的各种生物学过程，并证实与肿瘤病理特征关系显著，是重要的预后生物标志物[10-12]。然而miRNA-195在宫颈癌中发挥作用的机制尚未明确，因此研究拟探究miRNA-195 在宫颈癌中的表达及其发挥功能的潜在作用机制，以期为临床研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象 人宫颈癌siHa，Hela 细胞购于美国ATCC 细胞库，培养在含10ml/dl 胎牛血清的DMEM培养液中，加入100 µg/ml链霉素和100 IU/ml 青霉素；细胞培养瓶置于含5ml/dl CO2和95%湿度的37℃培养箱中。选取2018年1月～2020年12月期间河北北方学院附属第一医院病理科留存的35 例宫颈癌患者的癌组织及对应癌旁正常组织标本，所有组织均于术中获取，经病理确认后制成组织标本低温保存备用，采用qRT-PCR 检测基因表达。

1.2 试剂及仪器 胎牛血清、DMEM 培养液购自美国Hycolne 公司；链霉素、青霉素购自武汉卡诺斯科技有限公司；MTS 反应液购自北京百奥莱博科技有限公司；酶标仪、荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司；双荧光酶报告系统载体质粒、miR-195 mimics 和阴性对照NC-mimics 购于南京科佰生物科技有限公司；慢病毒转染CCND2和MYB质粒，CCND2 和MYB 干扰siRNA 由上海生物制药吉玛有限公司合成；Lipofectamine 2000，Trizol 购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒购自美国Qiagen公司；免疫蛋白印记所需试剂购自美国Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组：当生长密度达到80%左右，参照Lipofectamine 2000 说明书进行细胞转染，5ml/dl CO2，37℃，95%湿度条件下常规培养2 天。细胞转染分组：转染miRNA-195 mimics 细胞作为miRNA-195 过表达组（miRNA-195 组）；转染阴性对照NC-mimics 细胞作为阴性对照组（NC 组）；转染CCND2 和MYB 慢病毒质粒细胞作为过表达CCND2 组和MYB 组；转染CCND2 和MYB 干扰siRNA 细胞作为si-CCND2 组和si-MYB 组；同时设置空白对照组（Blank 组）。

1.3.2 实时荧光定量PCR 实验（qRT-PCR）：使用primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计特异性qPCR 引物；将反转录好的cDNA 用灭菌纯水稀释20 倍，按照qPCR mix 5 μl，primer 1 μl，cDNA 4 μl 的配方加入到96 孔PCR 板中；贴膜，以2 500 r/min 离心1 min，将样品放入qPCR 仪器中进行实验，反应完成后拷贝数据进行分析。qPCR 引物序列如下：miR-195 正向：5’-TACGA CGAGAGAAATATTCGC-3’，反向：5’- ATGATTA GTTACGACACGTAG-3’；内参U6 正向：5’-GCTT GCGCACGACATATAGTAAGT-3’，反向：5’-CGCTT GAGCAATTTCGGTCTGCAT-3’。PCR 扩增条件：95℃ 15 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，循环40 次。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达。

1.3.3 细胞增殖实验：将10 cm 盘细胞，重悬于1 ml新鲜培养液中，用20 μl 可铺1 个96 孔板的密度铺细胞，每个实验组需3 个生物重复，铺好所需的实验孔数。在5ml/dl CO2，37℃条件下孵育。细胞贴壁后即可转染。48 h后，开始测量吸光度值（A值）。配制MTS 反应液，按照MTS∶培养液=1∶20 的比例配制反应液。每孔加入100 μl MTS 反应溶液，37 ℃继续培养。每隔30min 检测一次A值。将培养皿置摇床上低速振荡10s 以充分溶解结晶物。在490 nm 处测量各孔的A值，绘制细胞增殖曲线。实验重复3 次。

1.3.4 划痕迁移实验：10 cm 盘的1/4 铺整个6 孔板，待细胞贴壁后分别转染，待细胞长到90%用枪头在盘中央划痕，保证枪头划痕时垂直，PBS 清洗，去除划下细胞，加入无胎牛血清培养液，37℃，5ml/dl CO2培养0，24 h 后拍照观察并记录。实验重复3 次。

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验：将宫颈癌细胞接种到6 孔培养板中，使其密度为90%。将含有海肾荧光素酶报道质粒的野生型CCND2 3’ UTR-wt，MYB 3’ UTR-wt 和突变型CCND2 3’ UTR-mut，MYB 3’ UTR-mut 转染至细胞中，使用双重荧光素酶测定系统（Promega，Beijing，China）测量荧光素酶活性，根据生产商的说明将其转染48 h 后根据海肾荧光素酶活性进行标准化。实验重复3 次取平均值。

1.3.6 蛋白免疫印迹实验：将细胞进行蛋白定量并制样，准备电泳、电转装置、电泳液以及电转液，装样品加入在凝胶中，100 V 进行电泳，待蓝色条带跑出即进行电转，100 V 电转2 h，将蛋白膜放在牛奶中封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，洗膜4 次，每次5 min，室温孵育二抗1 h，洗膜4 次，每次5 min，暗房显影。

1.3.7 miRNA-195 与宫颈癌预后的关系：通过生物信息学网站和Kaplan-Meier Plotter[13]数据库检索miRNA-195 在宫颈癌中的表达及与预后的关系。

1.3.8 microRNA 靶标预测：通过microRNA[14]网站进行预测miRNA-195 结合CCND2 和MYB 的具体位点，从而进行进一步研究。

会计集中核算要完成监管资金运动的全过程，要事前预算、事中控制以及事后追踪资金的开销情况。比如：在进行报销以及结算等相关工作的时候，核算处的工作人员要审核资金支出单位的原始票据等相关凭证。在电脑联网以及构建好会计审核体系之后，要全面掌控以及跟踪资金的流动以及实际支付情况，尽可能防止祸患的发生。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组比较采用one-way ANOVA 分析，组间两两比较采用LSD-t检验；宫颈癌组织及癌旁正常组织中表达比较采用配对t检验；Spearman 分析CCND2 和MYB 表达与miRNA-195 表达的相关性；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-195 在宫颈癌中的表达特征 qRT-PCR检测显示，35 例临床宫颈癌组织标本中miRNA-195表达较癌旁正常组织显著降低（21.03±5.17 vs 40.67±7.92），差异有统计学意义（t=12.285，P＜0.001）。通过检索生物信息学网站及Kaplan-Meier Plotter 数据库发现，宫颈癌中miRNA-195表达下调，具有显著的低表达预后差临床特征（LogrankP=0.032），见图1。表明miRNA-195 在宫颈癌的发生发展中具有重要作用。

2.2 细胞转染效率验证 qRT-PCR 检测显示：阴性对照NC 组(1.11±0.08）与Blank 组（1.09±0.07）miRNA-195相对表达无明显差异（t=0.326，P= 0.761),miRNA-195 过表达组（1.74±0.15）miRNA-195 相对表达较Blank 组（1.09±0.07）显著升高（t=6.801，P＜0.01），提示细胞转染效率成功可用于后续实验。

2.3 miRNA-195 对宫颈癌细胞增殖、迁移的影响 见表1。细胞增殖实验检测显示，转染第3，4，5 天时，miRNA-195 组siHa 和Hela 细胞增殖能力较NC 组显著降低，差异均有统计学意义（t=6.725～21.433，P＜0.01）。细胞划痕实验检测见表2。miRNA-195 组siHa 和Hela 细胞迁移速率较NC 组显著减慢，差异有统计学意义（t=12.443，16.749，均P＜0.001），提示miRAN-195 过表达抑制了宫颈癌细胞的增殖和迁移。

表1 miRNA-195 对宫颈癌siHa 和Hela 细胞增殖A 值的影响（±s）

表1 miRNA-195 对宫颈癌siHa 和Hela 细胞增殖A 值的影响（±s）

时间siHa t P Hela t P NC 组miR-195 组NC 组miR-195 组第1 天0.12±0.010.11±0.011.2250.2880.17±0.010.15±0.012.4490.070第2 天0.26±0.040.19±0.032.4250.0720.26±0.030.21±0.012.7390.052第3 天0.45±0.010.21±0.0220.139＜0.0010.40±0.020.26±0.036.7250.003第4 天0.61±0.020.26±0.0221.433＜0.0010.51±0.020.28±0.0311.049＜0.001第5 天0.72±0.050.27±0.0115.286＜0.0010.58±0.030.29±0.0213.931＜0.001

表2 miRNA-195 对宫颈癌siHa 和Hela 细胞迁移率的影响（±s，%）

表2 miRNA-195 对宫颈癌siHa 和Hela 细胞迁移率的影响（±s，%）

细胞NC 组miRNA-195 组tP siHa78.75±1.3258.63±2.4712.443＜0.001 Hela79.03±2.2151.59±1.7816.749＜0.001

2.4 miRNA-195 靶基因的预测及验证 检索micro RNA 网站发现，CCND2 和MYB 的3’-UTR 区都含有潜在的miRNA-195 结合序列（见图2a）。经双荧光素酶报告基因实验验证发现，miRNA-195 使野生型CCND2-wt 和MYB-wt 荧光素酶活性显著降低（P＜0.01），而对突变型CCND2-mut 和MYB-mut荧光素酶活性无显著影响（P＞0.05，见图2b），证实CCND2 和MYB 是miRNA-195 的靶基因。qRTPCR 和蛋白免疫印迹实验检测发现，miRNA-195过表达可直接抑制CCND2 和MYB 的 mRNA 和蛋白表达（见图2c，表3），提示miRNA-195 可能通过直接结合并抑制CCND2 和MYB 表达，从而在宫颈癌发生发展中发挥功能。

图2 miRNA-195 与MYB 和CCND2 结合及调控关系验证

表3 miRNA-195 对MYB 和CCND2 mRNA表达的影响（±s）

表3 miRNA-195 对MYB 和CCND2 mRNA表达的影响（±s）

注：与blank 组或NC 组相比，※P＜0.001。

组别siHaHela MYB mRNACCND2 mRNAMYB mRNACCND2 mRNA Blank 组1.00±0.011.01±0.011.00±0.011.00±0.02 NC 组0.98±0.020.97±0.030.99±0.010.98±0.01 miRNA-195 组0.32±0.02※0.27±0.03※0.29±0.03※0.31±0.02※F 947.312820.4211035.7271142.333 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 CCND2 和MYB 在宫颈癌组织中的表达及与miRNA-195 的相关性 qRT-PCR 检测发现，35 例临床宫颈癌组织（52.67±4.79）中CCND2 表达较癌旁正常组织（39.86±6.39）显著高表达（t=12.453，P＜0.001）；同时MYB 较癌旁正常组织亦显著高表达（43.06±6.43 vs 22.07±6.85），差异有统计学意义（t=13.217，P＜0.001）；Spearman 相关性分析显示，宫颈癌组织中CCND2 和MYB 表达分别与miRNA-195 表达呈负相关（r=-0.726，-0.592，均P＜0.05）。

2.6 CCND2 和MYB 表达对宫颈癌细胞增殖、迁移的影响 见表4。以Hela 细胞为例转染慢病毒质粒和干扰siRNA 分别过表达和敲低CCND2 和MYB 表达，经细胞实验检测发现，转染培养5 天后，过表达CCND2 和MYB 明显促进了宫颈癌细胞的增殖和迁移速率，而敲低CCND2 和MYB 表达则得到与之相反的结果（F=144.947～875.160，allP＜0.001），由此说明CCND2 和MYB 的致癌基因属性。

表4 CCND2 和MYB 表达对细胞增殖、迁移的影响（±s）

表4 CCND2 和MYB 表达对细胞增殖、迁移的影响（±s）

注：与Blank 组相比，*P＜0.001。

类 别Blank 组CCND2 组MYB 组si-CCND2 组si-MYB 组FP增殖A 值0.56±0.040.87±0.05*0.84±0.07*0.24±0.02*0.21±0.03*144.947＜0.001迁移率(%)81.01±2.1594.23±3.21*95.46±2.57*64.28±1.76*62.89±2.63*875.160＜0.001

2.7 miRNA-195靶向调控CCND2 和MYB 表达抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移 见表5。研究通过回补实验在过表达miRNA-195 细胞中分别回补过表达CCND2 和MYB，发现miRNA-195 对细胞增殖和迁移速率的抑制作用被逆转，细胞水平基本回归到正常值（P＞0.05），说明miRNA-195 可通过直接靶向调控CCND2 和MYB 表达在宫颈癌中发挥作用。

表5 miRNA-195 调控CCND2 和MYB 对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响（±s）

表5 miRNA-195 调控CCND2 和MYB 对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响（±s）

注：与Blank 组相比，※P＜0.001。

类 别Blank 组miR-195 组miR-195+CCND2 组miR-195+MYB 组FP增殖A 值0.56±0.030.30±0.02※0.53±0.020.54±0.0369.038＜0.001迁移率(%)80.13±1.2558.63±2.47※79.46±2.9178.98±3.2549.159＜0.001

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率居高不下，其早期不易发现，一经发现往往处于中晚期，复发、侵袭和转移率较高，导致患者预后不良。近年研究发现，宫颈癌的发生发展是一个非常复杂的过程，涉及从正常宫颈上皮细胞到癌细胞浸润的许多编码和非编码基因的结构和表达异常[15]。作为单链非编码RNA，miRNA 通过参与靶基因表达的调控，在细胞增殖、凋亡、分化和迁移等生物学过程中发挥作用[3-4]。如miRNA-6744-5p 在乳腺癌中通过促进anoikis 并直接靶向NAT1 酶，调控细胞的增殖、迁移等行为[16]。microRNA-198 促进了食管癌的迁移、侵袭和转移[17]。miRNA-200b-3p 可通过Wnt1 抑制结肠癌的迁移和侵袭[18]。表明miRNAs 在肿瘤发生发展中发挥重要作用，故探究不同miRNAs 在宫颈癌中的作用及调节机制极具意义。

近年研究证实，miRNA-195 作为癌症抑制基因在人类多种癌组织中表达下调，与肿瘤的发生密切相关。如PARESH 等[19]研究报道，乳腺癌细胞中miRNA-195通过靶向丝裂蛋白-2调节线粒体功能，参与调控乳腺癌细胞的增殖、迁移。miRNA-195通过靶向WNT3A 抑制结肠癌增殖和转移[20]。miRNA-195 通过靶向HMGA1 逆转胃癌细胞5-FU耐药[21]。miRNA-195 通过靶向SOX4 抑制子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间充质转化(EMT)[22]。而本研究探究发现miRNA-195 在宫颈癌组织中显著低表达，具有低表达预后差特征；细胞实验证实，过表达miRNA-195 显著抑制了宫颈癌细胞的增殖和迁移速率，表明其低表达在一定程度上参与了宫颈癌的发生发展，扮演抑癌基因角色。

细胞周期的运行关系细胞的增殖、凋亡和分化，是肿瘤发生发展的关键因素之一。研究报道，miRNA-195 通过调控靶基因与细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）决定了细胞在整个细胞周期中的进程[11]。CCND2 是重要的细胞周期蛋白，可与CDK4 或CDK6 形成复合物，调控细胞周期G1 期向S 期的转化，参与调控细胞增殖过程[23]。证实CCND2 在包括卵巢癌等一系列肿瘤中高表达，抑制该基因可抑制癌细胞的增殖，与肿瘤的发生显著相关[24]。MYB 是广泛存在的直接转录因子，最初被认为是v-MYB 的细胞同源物，后来被表征为几种类型的人类癌症中的转化癌基因，发现MYB 在多种癌组织中高表达与患者预后不良有关[25]。MYB 通过激活靶基因（例如环氧合酶2，B 细胞淋巴瘤2 和c-MYC）的转录及调节肿瘤相关转移基因表达可调节细胞周期G1/S 期转化，影响多种细胞的增殖、分化和侵袭、转移[26]。因此本研究进一步探究了宫颈癌中CCND2 和MYB表达与miRNA-195 之间的作用关系，首先研究证实宫颈癌组织中CCND2 和MYB 显著高表达，分别与miRNA-195 表达呈负相关；通过检索数据库预测发现，miRNA-195 与CCND2 和MYB 存在结合位点，荧光素酶报告基因实验证实CCND2和MYB 是miRNA-195 的靶基因。相关研究也证实，miRNA-195 可靶向抑制非小细胞肺癌细胞中的MYB 表达，并与MYB mRNA 中的3’非翻译区进行结合，从而调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[27]。心肌细胞中，miRNA-195 可通过下调c-MYB 蛋白的表达水平，从而参与调节心肌细胞的凋亡；LncRNA ZFAS1 通过miRNA-195/MYB 轴增强儿童急性髓系白血病阿霉素耐药[28]。可见，miRNA-195，CCND2 和MYB 在癌症进程中存在一定的调控关系。为进一步明确miRNA-195 发挥功能作用的方式，研究经细胞实验探究发现，过表达miRNA-195 显著抑制了CCND2 和MYB的表达，过表达CCND2 和MYB 则显著促进宫颈癌细胞的增殖和迁移，证实了CCND2 和MYB 的致癌基因属性。细胞回补实验证实，回补过表达CCND2 和MYB 能够抑制过表达miRNA-195 对细胞增殖、迁移速率的抑制作用，提示miRNA-195 可通过调控CCND2和MYB基因表达发挥功能，参与调节宫颈癌的发生发展。然而miRNAs 调控肿瘤发生的作用机制及分子信号通路复杂，故miRNA-195 调控宫颈癌发生的更深入具体作用机制后期还需继续探究阐明。

综上所述，miRNA-195 在宫颈癌组织中低表达，其通过靶向抑制致癌基因CCND2 和MYB的表达从而促进宫颈癌的进程，在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。