基于GEO数据筛选卵巢癌细胞对紫杉醇耐药基因及相关分子机制与治疗药物实验探讨

朱家凤，苏 琦(西北妇女儿童医院药剂科，西安 710061)

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤，流行病学调查显示其发病率居女性恶性肿瘤第3 位，死亡率居首位[1]。目前，化疗是卵巢癌重要的治疗方式，在卵巢癌初治患者、复发性患者及新辅助化疗患者中均获得可靠效果[2]。而其中紫杉醇联合铂类化疗长期以来被认为是卵巢癌的标准化疗方案，广泛用于临床[3]。但随着紫杉醇临床应用的推广，其耐药问题逐渐引起临床重视，紫杉醇耐药已成为影响化疗效果的主要因素[4]。目前认为卵巢癌对紫杉醇耐药与基因分子有关，且其机制呈多层次、多途径、多基因特点[5]。既往已有关于ACO1，BDNF基因在卵巢癌耐药中作用的报道，但仍不能完全阐明其机制[6]。本研究采用生物信息分析方法，利用基因芯片技术分析与卵巢癌紫杉醇耐药的相关基因，以此筛选对紫杉醇耐药卵巢癌患者的治疗新药，并通过体外细胞株培养干预进行验证，以期为紫杉醇耐药卵巢癌患者的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源 50 株人卵巢上皮癌细胞株OC3由军事医学科学院分子生物学实验室惠赠，参照李红霞等[7]方法构建紫杉醇耐药的卵巢癌OC3/TAX300 细胞株，并存于液氮罐中保存备用。

1.2 仪器与试剂 血根碱(上海源叶生物科技有限公司，B21412-20mg)，紫杉醇注射液(扬子江药业集团有限公司，国药准字H20058719)，MTT溶液(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PB180519)，DG5031 型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。

1.3 方法

1.3.1 差异表达基因的筛选：在基因表达数据库(gene expression omnibus，GEO)中筛选并下载对紫杉醇耐药的卵巢癌患者的耐药基因表达谱芯片GSE15372 和GSE28784（网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）。将GSE15372 和GSE28784 芯片数据录入R 语言，采用RMA 标准化法对数据进行预处理，然后以Bioconductor 软件中limma 包对差异表达基因进行筛选，设置|logFC|≥1.0，校正后P＜0.05 为差异表达倍数筛选标准，采用edge R 包绘制差异基因表达热图，记录数据集中上调和下调基因。

1.3.2 共同差异表达基因的富集分析：采用DAVID工具对共同差异表达基因进行基因本体论(gene ontology，GO)功能注释、京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)生物学通路分析。

1.3.3 紫杉醇耐药关键基因的筛选：采用STRING工具对共同差异表达基因进行分析，构建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络并导出，采用Cytoscape 进行可视化处理，挖掘对紫杉醇耐药的卵巢癌相关基因编码的关键基因。

1.3.4 紫杉醇耐药卵巢癌患者药物的筛选：将共同差异表达基因载入Enrichr 在线平台，根据Connectivity Map 筛选对紫杉醇耐药的卵巢癌患者的治疗药物，设置筛选标准为：综合得分＞10 分，

P＜0.01。

1.3.5 紫杉醇耐药的卵巢癌OC3/TAX300 细胞株复苏：将OC3/TAX300 细胞株置于37℃水浴锅中解冻。取细胞悬液，常规离心后弃上清液，加入6ml培养液，在37℃，5ml/dl CO2恒温箱内培养，使卵巢癌细胞株复苏并生长，在细胞进入对数生长期后进行传代。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.6 卵巢癌细胞的增殖实验：取对数生长期细胞，调整浓度为5×104/ml，每孔接种100μl，接种于96 孔培养板，在细胞贴壁后加入血根碱1.0，3.0 及5.0 μmol/L，紫杉醇50μg/L 和空白对照，培养72 h 后加MTT 5 mg/ml，继续培养4h，每孔加DMSO 150μl，低速震荡混匀后隔夜，采用酶联免疫检测仪检测吸光度A值，计算癌细胞增殖率。增殖率=(A实验组-A对照组)/A对照组×100%。

1.3.7 卵巢癌细胞的侵袭实验：取对数生长期细胞，分别给予含有血根碱1.0，3.0 及5.0 μmol/ L 及紫杉醇50 μg/ L 的无血清DMEM 处理，另设空白对照组，培养72 h。在Transwell 小室的上室内加10%基质胶，并将其接种至上述细胞，在Transwell 下室内加入含10 ml/dl 胎牛血清的DMEM，处理24 h后擦去上室内基质胶和细胞，以0.4 g/dl台盼蓝染色，随机取5 个视野，在显微镜下记录侵袭细胞数。

1.4 统计学分析 选用SPSS 20.0 软件包对数据进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌共同差异表达基因的筛选 见图1。经标准化预处理后GSE15372 和GSE28784 芯片数据集各样本基因表达均衡，具有可比性。其中GSE15372 数据集筛选出上调基因349 个，下调基因287 个。GSE28784 数据集中筛选出上调基因338个，下调基因246 个。分别对两数据集耐药细胞株中上调和下调的差异表达基因取交集，得到共同差异表达基因，其中上调143 个，下调83 个。

图1 卵巢癌共同差异表达基因的筛选

2.2 GO 和KEGG 分析 见图2。对共同差异表达基因进行GO 和KEGG 分析。GO 分析显示，共同差异表达基因参与DNA 复制和代谢过程、胆固醇代谢、染色体细胞组分、辅酶结合及腺嘌呤核苷酸结合等分子功能。KEGG 分析显示共同差异表达基因参与细胞周期、蛋白酶体及萜类化合物骨架生物合成等肿瘤信号通路。

图2 共同差异表达基因GO 和KEGG 分析

2.3 紫杉醇耐药关键基因的筛选 见表1。Cytoscape 软件分析共同差异表达基因编码蛋白间相互作用，构建PPI，得出与紫杉醇耐药相关的关键基因。

表1 紫杉醇耐药的关键基因

2.4 紫杉醇耐药卵巢癌患者治疗药物的筛选 见表2。根据Connectivity Map 模块分析结果，筛选紫杉醇耐药卵巢癌患者的治疗药物。根据药物对应关键基因的数目进行排序，确定潜在候选药物为血根碱。

表2 紫杉醇耐药卵巢癌患者治疗药物的筛选

2.5 不同分组患者卵巢癌细胞增殖率和细胞侵袭情况的比较 见表3。1.0，3.0 及5.0 μmol/L 血根碱组、紫杉醇组及空白对照组的卵巢癌细胞增殖率和侵袭数目比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。不同浓度血根碱组的卵巢癌细胞增殖率和侵袭数目显著低于紫杉醇组和空白对照组(t=2.341～8.720，均P＜0.05)。紫杉醇组和空白对照组的卵巢癌细胞增殖率和侵袭数目比较差异无统计学意义(t=0.543，0.389，均P＞0.05)。1.0，3.0 及5.0 μmol/ L 血根碱组组间卵巢癌细胞增殖率和侵袭数目比较，差异具有统计学意义(t=2.380～5.677，均P＜0.05)。

表3 不同分组患者卵巢癌细胞增殖率和细胞侵袭情况的比较

3 讨论

卵巢癌恶性程度高，预后差。长期以来紫杉醇作为卵巢癌的一线化疗药物被用于临床，但近年来调查显示其耐药现象逐渐普遍[8]。紫杉醇耐药是多基因参与，涉及信号通路传导、细胞凋亡及药代动力学等多层次的生物学事件。目前研究认为基因异质性与卵巢癌耐药密切相关，基因异质性是引起细胞变性和肿瘤异质性的重要原因，其中基因变异、缺失、甲基化参与这一过程[9]，影响肿瘤细胞增殖和侵袭，进而产生耐药。因而采用生物信息方法，利用基因芯片数据分析筛选差异基因，并进行基因富集分析，构建PPI 模型，以此挖掘潜在治疗药物，成为探索对紫杉醇耐药的卵巢癌患者治疗药物的新的途径。吴波等[10]也认为基因芯片数据分析能快速识别靶标，为探讨耐药的基因分子机制和开发新药提供参考。

本研究利用NCBI 平台提供的GEO数据库，首先筛选对紫杉醇耐药的卵巢癌患者相关基因数据集芯片，再通过R 和Bioconductor 软件筛选差异基因，进而根据富集分析和PPI 的构建，筛选耐药关键基因，获得可能对紫杉醇耐药卵巢癌患者治疗有效的潜在药物，并通过体外肿瘤细胞培养和干预验证对结果进行验证，以此为临床干预提供依据。研究结果发现血根碱对应的紫杉醇耐药关键基因的数目最多，提示血根碱可能对紫杉醇耐药卵巢癌患者有效。体外研究结果也显示不同浓度血根碱对卵巢癌OC3/TAX300 细胞株的增殖侵袭均具有抑制作用，且这种作用具有剂量依赖性，这进一步验证血根碱有望成为对紫杉醇耐药卵巢癌的潜在治疗药物，这一结果对于指导临床具有重要的实用价值。

细胞周期失控不仅是肿瘤发生发展的重要诱因，还参与肿瘤耐药机制[11]。CDK2 属细胞周期蛋白依赖性激酶，基础研究显示CDK2 可与Cyclin A结合，形成具有激酶活性的复合物，发挥生物学功能[12]。本研究也发现CDK2 是卵巢癌患者紫杉醇耐药的关键基因，这可能是因CDK2 激酶活性的增强，引起肿瘤DNA 复制异常和肿瘤细胞周期紊乱，发生细胞逃逸，产生耐药[13]。hMSH2基因是错配修复家族重要成员，研究证实肿瘤非耐药患者DNA双螺旋结构中A-T 与C-G 氢键处于互补配对的稳定状态[14]，对紫杉醇耐药的卵巢癌患者hMSH2基因异常高表达，这可能是因紫杉醇的应用可能损伤卵巢癌肿瘤细胞DNA，激活hMSH2基因，进而启动其修复机制，引起碱基错配和DNA 插入缺失，从而对抗紫杉醇药效[15]，产生耐药现象。另外，研究还显示MCM4 也是紫杉醇耐药的重要基因，MCM4 是MCM 单体，参与调节肿瘤DNA 复制。MCM4 功能失调可引起DNA 复制异常和染色体缺陷，进而影响肿瘤细胞增殖、转录[16]，成为紫杉醇耐药的原因。

由于本研究涉及的基因数较多，未能对上述基因在紫杉醇耐药中的作用进行一一验证，后期拟采用基因敲除法深入分析各基因在卵巢癌紫杉醇耐药中的作用及其机制。本研究根据关键基因筛选结果，利用Enrichr 平台的CMap 在线工具，并通过数据库的检索和体外实验，最终确定血根碱可作为潜在治疗药物，这为紫杉醇耐药卵巢癌患者临床治疗新药的开发提供了依据。血根碱属苯并菲啶类生物碱，近年来研究已证实血根碱具有抗肿瘤效应[17]，其中ErbB 信号通路与血根碱对紫杉醇耐药卵巢癌的治疗作用有关，JUN 和AREG 是ErbB 通路主要作用基因，ErbB 通过磷酸化，并与EGFR 家族成员结合，活化酪氨酸激酶，进而调节下游信号通路[18]，促进卵巢癌细胞的分化凋亡，进而对抗肿瘤细胞耐药。

综上所述，卵巢癌紫杉醇耐药与CDK2,hMSH2,MCM4,JUN 及EGFR 等关键基因有关，血根碱有望成为对紫杉醇耐药的卵巢癌患者的新的潜在治疗药物。