血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3水平联合检测对原发性肝癌的诊断价值

刘国振，陈秀余，张修欢（安徽医科大学附属六安医院/六安市人民医院核医学科,安徽六安 237005)

原发性肝癌(primary liver cancer)仍然是全世界范围最常见和最致命的癌症之一。在1990～2015年之间，原发性肝癌的发病率显著增加，2018年在全球范围内估计有84 万新病例和781 000 例原发性肝癌死亡病例[1]，且发病有上升趋势。肝穿刺活体组织检查被认为是检测原发性肝癌的最可靠方法[2]，但为创伤性检查，患者伴有出血或针道转移风险。血清微小RNA（microRNA，miR）-122-5p，miR-486-5p 被认为是肝脏的特性miRNA，通过多靶点作用参与肝癌的发生及发展，甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是用于原发性肝癌辅助诊断的最常用血清指标，甲胎蛋白异质体(alpha-fetoprotein heteroplasm,AFP-L3)是血清中甲胎蛋白与小扁豆素结合的部分，是肝癌患者血清中AFP 的主要糖型，为减少肝穿刺风险，提高原发性肝癌的诊断率，本研究探讨血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3 联合检测对原发性肝癌的诊断价值，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年2月～2020年5月于六安市人民医院确诊的原发性肝癌患者100 例作为观察组，其中男性69 例，女性31 例，年龄31～84 岁，平均年龄57.74±6.92 岁；同期本院治疗的良性肝脏疾病患者88 例，男性59 例，女性29 例，年龄33～85 岁，平均年龄56.81±7.12 岁；同期本院健康体检者80 例为空白对照组，男性41 例，女性39 例，年龄33～84 岁，平均年龄56.72±7.41 岁。三组性别、年龄相比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。诊断标准：①原发性肝癌诊断标准参照《原发性肝癌的分层筛查与监测指南(2020 版)》[3]；②良性肝脏疾病中乙型肝炎诊断参照《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[4]，药物性肝病诊断标准参照《药物性肝损伤诊治指南》[5]，非酒精性脂肪性肝病诊断参照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[6]，酒精性肝病诊断参照《酒精性肝病防治指南(2018 更新版)》[7]。纳入标准：①符合原发性肝癌及良性肝脏疾病诊断标准；②年龄31～84 岁；③患者未接受过抗病毒等药物及对症治疗；④患者病例资料完整。排除标准：①肝癌患者病情恶化迅速，预计生存时间不足3 个月者；②患有精神意识障碍；③并发慢阻肺、甲亢、糖尿病及高血压等慢性疾病患者；④患者依从性较差。

1.2 仪器与试剂 血清AFP，AFP-L3 试剂盒[博奥赛斯(天津)生物科技有限公司]，Applied Biosystems 实时荧光定量PCR 仪器（赛默飞世尔科技有限公司），紫外可见分光光度计UV754N(德国菲索牌)，miScript II 逆转录试剂盒(50)及miScript SYBR GREEN PCR Kit 试剂盒（德国Qiagen 牌）。

1.3 方法

1.3.1 ①血清miR-122-5p，miR-486-5p 测定：采集患者晨起空腹肘静脉血5ml，2 500 r/min，4℃离心15min，收集上层血清。采用Trizol 法提取总RNA，用紫外分光光度计测量吸光度值（A260nm/A280nm），当A值为1.8 ～2.2 时继续下一步实验。本研究引物由北京康维世纪公司合成并提供。用miScript ⅡRT 逆转录试剂盒（德国凯杰公司）进行逆转录反应，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，最后加入ddH2O 稀释。随后用miScrpt SYBR Green 试剂盒（德国凯杰公司）进行qPCR 反应，反应条件：加热95℃ 30min，变性94℃ 15s，退火55℃ 30s，延伸70℃ 30s，共40个循环。本研究以U6为内参，用2-△Ct公式计算miR-122-5p 和miR-486-5p 相对表达量。miR-122-5p 上游引物5’-AGUUUUGCAUAGUUGC ACUCAC-3’，下游引物5’-AGUUUUGCAUAGUUG CACUCAC-3’；miR-486-5p 上游引物5’-UGUGCAAA UCCAUGCAAAACUGA-3’；下游引物5’-GCTCACT GCAACCTCCTCCTTCC-3’；内参U6 上游引物5’-G CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.3.2 血清AFP，AFP-L3 测定：采用上述方法分离血清，化学发光法测定血清AFP水平，测定AFP-L3 并计算AFP-L3%。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0 统计软件分析,符合正态分布的计量数据以均数±标准差(±s)表示，三组正态计量资料比较，应用方差分析，两组相互比较采用两独立样本t检验。计数资料以n(%)表示，两组比较采用卡方检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3的表达水平 见表1。观察组血清AFP及AFP-L3水平高于空白对照组及对照组（tAFP=32.635,25.368,均P＜0.05;tAFP-L3=22.071,13.529,均P＜0.05），对照组AFP及AFP-L3水平高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组血清miR-122-5p，miR-486-5p水平低于空白对照组及对照组（tmiR-122-5p=-5.546,-28.729,均P＜0.05;tmiR-486-5p=-6.527,-14.304,均P＜0.05），对照组miR-122-5p，miR-486-5p水平低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3的表达水平（±s）

表1 血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3的表达水平（±s）

项 目观察组(n=100)对照组(n=88)空白对照组(n=80)F 值P 值miR-122-5p0.27±0.110.38±0.160.92±0.199.5320.000 miR-486-5p0.36±0.210.57±0.220.84±0.2511.5160.000 AFP(ng/ml)332.48±24.3271.43±11.2412.29±3.2434.2530.000 AFP-L3(%)40.15±13.268.57±2.194.13±2.0516.8450.000

2.2 观察组不同病理下血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3水平比较 见表2。观察组不同病理下血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3水平比较发现，在性别、年龄及病灶数目上差异无统计学意义（t=-1.771～0.434，均P＞0.05），在肿瘤直径、TNM 分期、门静脉癌栓、脏器转移及淋巴结转移上差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 观察组不同病理下血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3水平比较（n=100，±s）

表2 观察组不同病理下血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3水平比较（n=100，±s）

临床参数n miR-122-5p t 值 P 值 miR-486-5p t 值 P 值AFPt 值 P 值AFP-L3t 值 P 值性别 男690.26±0.090.430 0.6680.35±0.180.243 0.808333.48±19.32-1.711 0.09042.15±9.26-1.161 0.249女310.25±0.140.34±0.23339.56±15.7644.27±8.95年龄(岁)≥60 480.25±0.080.434 0.6650.38±0.210.260 0.796352.68±23.17-1.197 0.23444.41±8.38-1.128 0.262＜60 520.24±0.140.37±0.17358.41±24.5846.27±8.11病灶（个）≥3620.34±0.210.211 0.8330.38±0.220.232 0.817341.92±21.24-1.030 0.30538.25±7.41-1.529 0.129＜3380.33±0.260.37±0.19346.62±23.5640.57±7.29肿瘤直径(cm)≥6340.11±0.03-4.550 0.0000.35±0.18-2.266 0.026408.27±33.7512.485 0.00046.97±9.196.822 0.000＜6660.19±0.100.47±0.28336.59±23.1735.65±7.09 TNM 分期 Ⅰ～Ⅱ 520.35±0.142.410 0.0180.51±0.312.460 0.016327.71±21.19-7.063 0.00038.09±7.46-6.270 0.000Ⅲ～Ⅳ 480.27±0.190.39±0.14358.61±22.5647.82±8.06门静脉癌栓 有570.36±0.153.403 0.0010.52±0.262.341 0.021349.07±21.356.620 0.00049.21±9.982.961 0.004无430.28±0.040.41±0.19321.91±18.8443.27±9.59脏器转移 有530.15±0.02-5.978 0.0000.45±0.272.253 0.026363.91±20.179.764 0.00037.55±7.61-4.798 0.000无470.25±0.120.34±0.21324.69±19.9144.87±7.62淋巴结转移 有480.22±0.15-3.103 0.0020.29±0.12-2.341 0.021320.18±15.57-7.132 0.00045.87±7.685.578 0.000无520.31±0.140.38±0.24346.85±21.1538.27±5.89

2.3 血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3检测价值 见表3。血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3 联合检测其敏感度和特异度分别为92.37%，90.45%，受试者工作特征曲线下面积AUC 为0.945，显著高于miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3 单一检测，差异有统计学意义（χ2=8.165，P＜0.05）。

表3 血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3 检测价值

3 讨论

原发性肝癌作为恶性肿瘤之一，其死亡率居高不下，多由病毒性肝炎及肝纤维化和肝硬化过程中发展而来，同时部分患者在慢性肝炎阶段可发展为原发性肝癌[8]，各种病因共同作用下导致肝脏细胞损伤，随后引发机体修复，在损伤修复的循环过程中可引发基因突变，患者的生物学特征发生改变，细胞的凋亡过程与增殖过程发生失衡，促进了癌症基因的表达，而抑癌基因遭到抑制[9]，加之病毒性肝炎患者长期炎症反应使血管活跃增殖，为原发性肝癌的产生创造了有利条件[10]，因此早期及时的诊断可提高患者的生存时间及生活质量。

肿瘤标记物是用于早期诊断恶性肿瘤的潜在筛选工具。因此，确定合适的标志物对原发性肝癌的早期诊断在临床上具有重要意义。AFP 是用于原发性肝癌辅助诊断的最常用血清指标，血清AFP水平与肿瘤直径、肿瘤分化和生物学特性有关。但是，某些患者的AFP水平在原发性肝癌的早期甚至晚期仍保持正常，而某些良性肝病患者显示AFP 结果为假阳性,因此AFP 检测在疾病早期阶段其敏感度较低[11]。AFP-L3 是血清中甲胎蛋白与小扁豆素结合的部分，是肝癌患者血清中AFP 的主要糖型，大约35%的原发性肝癌患者（肿瘤直径小于3cm）可以检测到[12]，一些临床研究表明，AFP-L3 可提前9～12 个月检测到，实际上AFP-L3 可以用作可靠的早期原发性肝癌患者的生物标志物，这一标志已被日本肝病学会证实[13]。AFP，AFP-L3 单一检测原发性肝癌其敏感度和特异度较低，较多报道显示联合检测对原发性肝癌的诊断价值更高，段云等[14]研究发现AFP，AFP-L3 联合检测诊断价值更高，灵敏度81.68%显著高于单一检测，随着病情发展其诊断能力越明显。王蓉等[15]通过荟萃分析发现，血清AFP-L3 和GP-73 联合检测对原发性肝癌的诊断灵敏度及准确度高于单一检测，其AUC可达0.981，是重要血清学指标。颜丽等[16]研究发现，血清TSGF,AFP,CEA 和FER 联合检测其特异度为88.9%，灵敏度为90.2%，对于肝脏恶性肿瘤的诊断价值最高。QI 等[12]研究发现，PIVKA-II，AFP-L3，AFP 和CEA 是诊断原发性肝癌的有效生物标志物,其AUC 可达0.910，与单独检测相比其联合检测可以提高诊断性能。THANAPIROM 等[17]研究发现，PIVKA-II，AFP-L3 及AFP 联合检测对原发性肝癌的诊断价值也高于单一检测，这与其它学者的研究一致。

近年来，miRNA 对基因表达的调控已成为各疾病研究中特别关注的问题，单个miRNA 可以由复杂miRNA-mRNA 网络中的多个miRNA 调控，miRNA表达失调被认为是各种人类疾病中的常见事件，miRNA 失调涉及的疾病包括脑卒中、心力衰竭、癌症等，因此miRNA 具有双向作用，使其成为潜在的诊断靶标[18]。血清miR-122-5p，miR-486-5p 被认为是肝脏的特性miRNA，何佳等[19]研究发现，miR-122-5p，miR-486-5p 在原发性肝癌患者血清中为低表达，因此两者可在原发性肝癌发展过程中起到负调控作用。谢静等[20]研究发现，长链非编码RNAFOXD2-AS1 可通过靶向上调miR-122-5p表达进而抑制肝癌细胞增殖、迁移及破坏。高俊[21]研究发现，基因间长链非编码RNA 01551通过miR-122-5p/ADAM10 信号轴促进原发性肝癌的发生发展。杨文聪等[22]研究发现，肝癌患者血清miR-122-5p，miR-486-5p表达水平低于健康人群，其中血清miR-122-5p 诊断原发性肝癌的灵敏度和特异度可达71.2%和84%，对于原发性肝癌的诊断具有重要价值。陈曦阳等[23]研究发现，血清miR-122-5p，miR-486-5P的表达水平低于肝炎组、肝硬化组及健康组，单项检测时，甲胎蛋白的AUC 为0.873，灵敏度为74.09%，miR-122-5p 的特异度为91.36%，血清miR-122-5p，miR-486-5P 联合检测高于其单项检测，证实血清miRNA 对原发性肝癌的诊断效能高，可作为原发性肝癌的辅助检查手段。

本研究结果显示，原发性肝癌患者血清miR-122-5p，miR-486-5p水平低于健康人及良性肝脏病患者，证实了miR-122-5p，miR-486-5p 参与肝癌患者血清表达，其表达水平越低则肝癌的发病率越高。

原发性肝癌是最常见的癌症，手术引发肝癌复发的不良预后现在是人类健康的大问题。在所有原发性肝癌病例中，人类约占70%～80%。在临床实践中，肝癌的诊断主要取决于血清标志物或图像检测。据报道，手术治疗后的五年肝癌患者生存率为40%，但对于早期诊断的患者，其五年生存率将提高到60%～70%，特别是对于原发性肝癌患者，生存率可达到90%[24]。因此，迫切需要发现更敏感、更特异的生物标志物，以早期诊断肝癌。在肝癌的早期阶段，miRNA的表达可能会异常，由于miRNA 在血液中稳定，并且对极端温度和pH 值具有抵抗力，miRNA 可成为肝癌的生物标志物。细胞的遗传表达与miRNA有关，因此对miRNA 进行基因调控的关键任务是发现新的miRNA 并确定其靶标。同时，miRNA 在转录后的基因调控中起着重要作用。mRNA 的稳定性和翻译受到负面调控，可能是通过在靶转录物上募集不同的效应蛋白组合来实现的[25]。大量工作表明，miR-122-5p，miR-486-5p 参与了大多数原发性肝癌细胞的增殖、迁徙与凋亡过程，对于确定和鉴定原发性肝癌至关重要。本研究结果发现，原发性肝癌组患者不同病理下血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3水平比较发现，原发性肝癌病人肿瘤越大，TNM分期越高，发生淋巴结转移、脏器转移和有门静脉癌栓的概率越大，原发性肝癌病人血清miR-122-5p，miR-486-5p表达水平越低，血清AFP，AFP-L3表达水平越高，对于原发性肝癌诊断价值越高，血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3 联合检测的诊断价值显著高于单一检测。本研究存在研究样本量小、筛选miRNA 数量有限并对其具体作用机制尚不清楚等局限性，未来仍需要扩大样本量并进行深入研究。本研究提供了对于原发性肝癌联合检测的检测方法，作为无创检测方法可在临床广泛使用，提高诊断准确率。

综上，血清miR-122-5p，miR-486-5p，AFP及AFP-L3 联合检测可提高原发性肝癌的诊断价值，血清miR-122-5p，miR-486-5p 在原发性肝癌患者血清中低表达，与疾病的发生发展及预后有关，可成为诊断原发性肝癌的重要生物标志物。