近海浅海海水弗朗西斯菌的分离培养和鉴定

陈富 李敏 冯俊慧 罗海敏 李良慧 廖焕兰 屈平华 李松

1广州市番禺区健康管理中心，广州 511490；2中山大学肿瘤防治中心，广州 510006；3广州中医药大学第二临床医学院，广州 510006；4广州中医药大学第二附属医院 广东省中医院检验医学部，广州 510006

弗朗西斯菌是一类革兰染色阴性、营养要求苛刻、专性需氧的球杆菌。其广泛存在于海洋、淡水、人工水、土壤等自然生境中，可通过接触病畜、食入污染的食物、吸入污染空气等多种方式传播给人类，且临床感染遍布全球，仅蜃楼弗朗西斯菌的临床感染报道就有几十例［1］，目前在我国也有相应的感染报道的案例［2］。弗朗西斯菌多数都是存在近海浅海海水中，而我国近海渔作业非常发达，作业人数众多，有一定的感染风险，因我们对这方面的了解极少，为加深对这一方面的认识和探索，本课题组就广东近海浅海中海水的弗朗西斯菌和邻近兼性胞内寄生菌的进行分离培养和多样性研究，以了解近海浅海海水的弗朗西斯菌和邻近兼性胞内寄生菌的分布情况。

材料与方法

1、材料

1.1、仪器和试剂 （1）主要仪器：分析精密电子天平T-114（美国丹佛仪器公司），高压蒸汽灭菌器（以色列腾氏公司），漩涡混合器Vortex（上海医大仪器厂），5% CO2恒温孵育箱（北京东方精瑞科技发展有限公司），恒温金属浴SH2-82（广州誉维生物科技仪器有限公司），冷冻离心机Eppendorf 5804R（德国Eppendorf 公司），微量离心机（珠海黑马医学仪器有限公司），Veriti 96 well PCR 仪（美国ABI公司），凝胶电泳仪DYY-7C（北京六一仪器厂），全自动凝胶成像系统（英国Syngene 公司）。（2）主要试剂：BHI 琼脂基础，军团菌CYE 琼脂基础，GVPC 选择性添加试剂（均购自英国OXOID 公司）；军团菌BCYE 添加剂：ACES 颗粒、氢氧化钾、α-酮戊二酸、焦磷酸铁、L-半胱氨酸（均购自上海生工生物工程有限公司）；2216E 液体基础（购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；革兰染色、氧化酶及触酶试剂（均购自法国生物梅里埃中国有限公司），Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂，Premix EX Taq Version 2.0，DL 2000 Marker（均购自上海生工生物工程有限公司），细菌16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R（购自上海英骏公司），Goldview 核酸染料（购自广州翔博生物科技有限公司）。

1.2、培养基的制备 BCYEα-2216E 培养基：CYE 琼脂基础12 g，ACES 颗粒5 g，氢氧化钾1.4 g，α-酮戊二酸0.5 g，焦磷酸铁0.125 g，L-半胱氨酸0.2 g，琼脂粉1 g，2216E 基础18.7 g，去离子水500 ml。BCYEα-2216E-GVPC 培养基：CYE 琼脂基础12 g，ACES 颗粒5 g，氢氧化钾1.4 g，α-酮戊二酸0.5 g，焦磷酸铁0.125 g，L-半胱氨酸0.2 g，琼脂粉1 g，2216E 基础18.7 g，甘氨酸1.5 g、万古霉素0.000 5 g、放线菌酮0.04 g 和多粘菌素B 40 000 U，去离子水500 ml。BHI-2216E-GVPC 培 养 基：BHI 琼 脂 基 础12.5 g，氯 化 铁0.162 5 g，L-半胱氨酸0.2 g，琼脂粉2.5 g，2216E基础18.7 g，甘氨酸1.5 g、万古霉素0.000 5 g、放线菌酮0.04 g 和多粘菌素B 40 000 U，去离子水500 ml。

2、方法

2.1、水样采集 于2019年10月4日茂名市电白区水东湾进行多位点采集水样19份；于2019年8月12日惠州市两大湾（巽寮湾、双月湾）进行多位点采集水样29份。

2.2、水样处理及培养 将采集的海水充分摇匀后，取100 ml 使用孔径为0.2 μm 的纤维素滤膜过滤浓缩，取滤膜对折剪碎后，置于新的5 ml EP 管中，加入3 ml原海水，在震荡仪上充分震荡，然后从中取1 ml，按1∶1 的比例加入1 ml KCl-HC（l18∶1）进行酸处理，震荡摇匀后静置5 min。将50 μl上述处理后的海水密集涂布于BHI-2216E-GVPC、BCYEα-2216E-GVPC两种培养基上，在25 ℃的5%CO2恒温孵育箱中培养3～7 d。

2.3、菌株鉴定

2.3.1、菌株形态和生理生化鉴定 定期观察培养基上菌落的生长情况，观察菌落特征并进行革兰染色观察，鉴定方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，挑选表面及边缘光滑、湿润、扁平、圆形、灰白色、半透明的疑似目标菌落进行触酶、氧化酶的生理生化检测，其传代培养和纯化均于BCYEα-2216E培养基上完成，培养条件与2.2一致。

2.3.2、16S rRNA基因测序 在BCYEα-2216E培养基上挑取3～4个实验菌株典型的菌落置于100 μl的DNA抽提试剂，并均匀研磨，充分混匀后置入恒温金属浴（105 ℃，10 min），在12 000 r/min的条件下离心3 min（离心半径为9.5 cm），吸取含DNA 的上清液，备用。引物序列正向：27F 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’，反向：1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’进行PCR 扩增。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行测试。DNA marker 取5 μl，每个样品取5 μl，电泳条件参数：120 V，25 min。电泳结束后将凝胶放进成像仪进行扫描成像观察条带：16S rDAN 条带应于1 400 bp 附近。取条带阳性、扩增良好的样品送广州艾基生物技术有限公司进行单向测序。

2.3.3、16S rRNA 基因序列比对 使用chromas 软件查看序列峰图，判断所得序列是否符合长度和质量的要求，然后将合格的序列使用DNAMAN 软件进行拼接，并在NCBI Blast数据库上进行相似度搜索并分析比对结果。

结 果

1、分离培养结果

水东地区采取的19 份水样，其中14 份（阳性率73.7%）水样培养出目标菌菌株共60 株，惠州地区采取的29 份水样，其中17 份（阳性率58.6%）水样培养出目标菌菌株共79 株。处理后的海水在BHI-2216E-GVPC 培养基和BCYEα-2216E-GVPC 培养基上于35 ℃培养3 d 后，可见灰白色，有光泽，湿润，有明显边界的大小1.5～3.0 mm 左右的目标菌落（图1），将目标菌落于血平板和BHI-2216E 培养基上进行生长试验，可见培养3 d后目标菌在血平板上菌落细小，明显生长不良或生长缓慢，而BHI-2216E培养基上生长良好。

图1 各分离培养基上目标菌的生长情况。A为BHI-2216E-GVPC 培养基；B为BCYEα-2216E-GVPC 培养基；C为BCYEα-2216E培养基；D为在BCYEα-2216E上分纯

2、目标菌株及生理生化特征

挑取目标菌落涂片并进行革兰染色。革兰染色阴性，淡染，呈细砂状，多形态性，表现为豆形、球形、杆状或丝状等形态，无鞭毛无动力，无芽胞（图2）。常规生理生化反应结果：触酶弱阳性，氧化酶阳性，硝酸盐还原试验阴性，脲酶阴性。

图2 目标菌革兰染色显微图。A为低倍镜下目标菌的形态图（10×10）；B为油镜下目标菌的形态图（40×10）

3、16S rRNA分子鉴定结果

挑选目标菌的单个菌落进行纯培养，对纯培养转代后的菌进行保存，选用弗朗西斯菌通用引物进行PCR扩增，扩增后的产物送公司进行测序，测序结果在gen-bank 上进行比对。水东地区采取的19 份水样，其中14 份（阳性率73.7%）水样培养出目标菌菌株共60 株，其中弗朗西斯菌属（有潜在新种）12 株（20.0%），嗜半胱氨酸菌属45 株（75.0%），方氏菌属1株（1.7%），其他临近属（潜在新科）2株（3.3%）；惠州地区采取的29 份水样，其中17 份（阳性率58.6%）水样培养出目标菌菌株共79 株，其中弗朗西斯菌属（有潜在新种）22 株（27.8%），嗜半胱氨酸菌属35 株（44.3%），方氏菌属4 株（5.1%），其他临近属（潜在新科）18株（22.8%）。具体见表1。

表1 不同采样地点16S rRNA基因序列比对结果

讨 论

弗朗西斯菌是一种寄养的，兼性细胞内寄生的革兰阴性杆菌，广泛存在于土壤、海洋、沼泽或小型哺乳动物、海洋鱼类、贝壳类等自然宿主体内。可通过空气中的气溶胶、接触疫水、创伤性伤口和接触弗朗西斯菌的自然宿主等方式感染人类［3］。最引起我们关注的是，

土拉弗朗西斯菌引起的人畜共患的土拉热病，随着各地都有爆发的土拉热病的报道，感染后具有发病率高、毒性大、传播性强等特点，而且日本、德国等都有对其作为生物战剂研究，所以美国以此作为长期防生化恐怖的重点监测目标。之前报道的土拉弗朗西斯菌感染途径主要是小哺乳动物宿主、节肢动物的叮咬等直接接触的传播途径，而1997 年西班牙爆发了水源性污染的土拉热病，土耳其也爆发了3 次的水源性污染的土拉热病，全球范围内也有多例的蜃楼弗朗西斯菌，且主要都是存在于近海浅海的海水里或咸水源中，对病原菌的分离培养和鉴定以了解其分布特点的重要性［4］。因此，海水或咸水也是弗朗西斯菌存在的重要地方，水源性的感染传播途径不容忽视，本文就近海浅海的海水中弗朗西斯菌的分离培养作为研究报道。

从我们分离军团菌属和弗朗西斯菌科细菌的经验来看，采样地点的选择、样本前处理策略以及培养基的选择和优化等，会大幅度提高其分离培养效果，并增加其相关类群的物种多样性描述。本项目团队在2011 年至2015 年间对1 288 份淡水进行弗朗西斯菌培养，但由于受到方法学上局限以及水样的选择不同上，仅检出3 份阳性水样，阳性率不足1%；而在2016年至2018年间，我们通过采样地点的选择以及采用热孵育和酸处理等释放原虫宿主内细菌和抑制其他杂菌生长的方法，分离的阳性率得以大幅度提高，在181 份海水和盐水湖标本中检出49 份阳性样品，并分离和描述了另弗朗西斯菌［5］、假弗朗西斯菌属［6］、嗜半胱氨酸菌［7］、苛养杆菌属［8］、易生杆菌属［9］和庆义军团菌［10］等5 个属10 余种。本文在进一步改良的模拟海水环境的CHABBHI-2216E-GVPC 培养基和增加广东地区近海浅海不同采样地点上多点采样，培养温度的控制，并根据细菌生长的适宜温度与海水温度之间差异的改变而尝试不同温度进行培养，发现在20～25 ℃之间适当延长培养时间，更能有机会发现目标菌。而我们在48 份海水中分离到31 份阳性水样，阳性率明显提高，对目标菌和相近菌种的获取概率也大大提高。

在进一步在近海浅海的分离鉴定中，不同地点的海水有着不同的温度、不同的盐度、不同的流动方向和速度等，都存在着不同的生态微环境，这也是导致菌群不一致的主要原因。而从本研究不同地点采集的水样分离结果来看，菌属的检出和比例都明显不同，水东地区的阳性水样中的目标菌大部分鉴定为嗜半胱氨酸菌属，占比高达75.0%，与惠州的嗜半胱氨酸菌属（44.3%）相差甚远。两个地方一共分离到弗朗西斯菌34 株，部分菌株的测序结果的对比相似度小于98.75%，根据最新的细菌分类指南里面对新种测序结果的要求，这些菌株存在新种的可能，后续我们会对潜在的新种按照新种确认的最低要求进行相关的检测。同时将对分离出的20株疑似新科的细菌进行后续确认检测工作。

通过分离培养条件的改进后，这次分离培养的阳性率明显提高，而且分离到多株弗朗西斯菌，且可能存在弗朗西斯菌的新种，还有多株接近于弗朗西斯菌的潜在新科新属等。同时了解到广东地区近海浅海海水中弗朗西斯菌种非常丰富，且存在不同的新种以及可能存在邻近菌属。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突