适度热胁迫对造礁石珊瑚热耐受性影响的研究

刘 旭，黄 雯，俞小鹏，吴志强1,*，余克服，王永刚，钟懋胜，王英辉

(1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004；2.广西南海珊瑚礁研究重点实验室，广西 南宁 530004；3.广西大学海洋学院，广西 南宁 530004；4.广西大学珊瑚礁研究中心，广西 南宁 530004)

引 言

珊瑚礁生态系统被誉为水下“蓝色沙漠中的绿洲”，具有保护海岸、维护生物多样性、维持渔业资源、吸引旅游观光等重要生态功能[1]。1998年—2018年发生过3次大规模的全球珊瑚礁白化事件[2-5]，研究表明厄尔尼诺加剧和全球变暖导致海水表面温度上升与珊瑚礁白化现象密切相关[6-7]，近几年由于海水表面温度上升导致的珊瑚白化的现象愈发严重，加上海岸开发和环境污染等因素的影响，珊瑚礁生态系统正面临着前所未有的危机。

Oliver[8]通过分析美属萨摩亚群岛的风信子鹿角珊瑚的存活率和光合速率，发现先前暴露于变化较大的环境使珊瑚共生体的耐热性增加，比仅由耐热共生体提供的耐受性强。Jessica[9]对吉尔伯特群岛中部和北部珊瑚骨骼生长速率和死亡记录调查结果表明，热胁迫对历史温度高的位置的珊瑚的影响较小，但不同种类珊瑚敏感性不同。有研究显示，适当的热胁迫对珊瑚响应热胁迫可能具有重要的促进作用[10-12]，Hoegh[13]和Donner[14]等人推测如果想要跟上全球气温变暖的步伐，建造珊瑚礁的珊瑚的耐热性必须每十年提升0.2～1.0℃。然而，目前对于提高珊瑚耐热性的研究非常少，他们的研究虽然提出了受到过热胁迫存活下来的珊瑚热耐受性会提高，但是都仅限于在海区观察，并没有进行模拟实验证明，研究十分薄弱。

Rachael[15]对矛枝鹿角珊瑚(Acroporaaspera)进行室内模拟实验，发现34 ℃胁迫时，经过31 ℃热驯化48 h的珊瑚暗适应后最大光量子产量和虫黄藻(zooxanthellae)密度显著高于未驯化组，恢复2周比恢复1周更显著。但他的研究仅限于粗糙鹿角珊瑚一种，且研究重点为驯化后恢复时间对珊瑚热耐受性的影响。

本研究目的是通过对三种造礁石珊瑚进行室内短期驯化模拟实验，探究造礁石珊瑚最大光合作用效率，共生虫黄藻密度和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Capspase-3)对温度胁迫高温胁迫的响应变化，最重要的是，本研究通过三种不同种造礁石珊瑚的短期驯化对温度胁迫高温胁迫的影响，来探讨短期驯化后珊瑚是否比直接胁迫珊瑚耐受性更高，以及对三种造礁石珊瑚耐受性影响的差异。以期为全球气候变化背景下，珊瑚礁的保护与修复提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 珊瑚样本

本研究所用的珊瑚样品分别采自广西涠洲岛(澄黄滨珊瑚，Poriteslutea；十字牡丹珊瑚，Pavonadecussata)和海南三亚(鹿角杯形珊瑚，Pocilloporadamicornis)，采集时间为2018年10月，水深2～3 m,实测水温为24～26 ℃。

1.2 实验设计

将珊瑚样本分为三组：空白对照组(C)，驯化组(R)，高温对照组(H)。保持所有实验缸的水体环境、光照时间一致。温度设计依据是，1998年全球珊瑚礁大规模白化事件发生的47个典型区域的海洋表面温度，变化区间为28.4 ℃～34.9 ℃[16]。李淑[17]的实验表明，32 ℃持续72 h，澄黄滨珊瑚、十字牡丹珊瑚和鹿角杯形珊瑚并未白化死亡。因此，我们将本实验驯化胁迫温度设置为32℃，驯化验证胁迫温度设置为34 ℃。图1为具体分组温度变化曲线和取样时间点。空白对照组：26 ℃(模拟自然环境)，取样记为C。驯化组：采用梯度升温，每12 h升高1 ℃，温度升至32 ℃持续3 d(模拟适度的高温胁迫)，进行第一次取样，记为A；采用梯度降温，每12 h降低1℃，降至26 ℃，恢复14 d，进行第二次取样，记为RA；采用梯度升温，每12 h升高1℃，升至34 ℃持续3 d(模拟高温胁迫)，进行第三次取样，记为RH。高温对照组：26 ℃的条件下暂养，与驯化组同时进行梯度升温，升至34℃持续3 d(模拟高温胁迫)，取样记为H。由于鹿角杯形珊瑚高温对照组在温度升至34 ℃后第2天就出现组织脱落、死亡的现象，故鹿角杯形珊瑚H取样时间为34 ℃持续2 d。为保持一致性，故鹿角杯形珊瑚驯化组RH取样时间也为34℃持续2 d。

图1 珊瑚样本分组温度变化和取样时间点示意图

2 研究结果

2.1 三种珊瑚在高温胁迫过程中的表型变化

32 ℃驯化胁迫：随着水体温度的升高，鹿角杯形珊瑚、澄黄滨珊瑚和十字牡丹珊瑚触手逐渐回缩，直至全部缩回，珊瑚颜色逐渐变浅，表面产生一层黏液。三种造礁石珊瑚中鹿角杯形珊瑚变化最为明显。在温度逐渐恢复至26 ℃后第3天开始，三种造礁石珊瑚触手逐渐伸展，随着恢复时间的推移珊瑚触手完全伸展，颜色也逐渐恢复，在第14 天时，已基本恢复至胁迫之前的水平。

34 ℃驯化验证胁迫：随着水环境温度的升高，鹿角杯形珊瑚的高温对照组出现触手紧缩，表面产生黏液，并在34 ℃第2天就开始出现体表组织脱落，骨骼露出的现象；驯化组触手全部紧缩，表面产生一层黏液，但并没有出现珊瑚体表粘液脱落，骨骼露出，死亡的现象。澄黄滨珊瑚的高温对照组在24 h后体表被一层光亮的黏液膜覆盖，触手全部缩回，颜色逐渐变浅；驯化组也出现粘液，但并没有形成黏液膜，触手全部缩回。十字牡丹珊瑚除了黏液增多，触手缩回外，并没有其他明显的现象。

C1: 澄黄滨珊瑚空白对照组(26 ℃), A1: 澄黄滨珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d), RA1: 澄黄滨珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d后26 ℃ 14 d), RH1: 澄黄滨珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d后26 ℃14 d, 又升至34 ℃ 3 d), H1:澄黄滨珊瑚高温对照组(34 ℃ 3 d), C2: 十字牡丹珊瑚空白对照组(26 ℃),A2：十字牡丹珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d), RA2: 十字牡丹珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d后26℃ 14 d), RH2: 澄黄滨珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d后26 ℃ 14 d,又升至34 ℃ 3 d), H2: 十字牡丹珊瑚高温对照组组(34 ℃ 3 d), C3: 鹿角杯形珊瑚空白对照组(26 ℃), A3：鹿角杯形珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d), RA3: 鹿角杯形珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d后26 ℃ 14 d), RH3: 鹿角杯形珊瑚驯化组(32 ℃ 3 d后26 ℃ 14 d, 又升至34 ℃ 2 d), H3: 鹿角杯形珊瑚高温对照组(34 ℃ 2 d)。

2.2 珊瑚共生虫黄藻密度和暗适应后最大光量子产量变化

图3显示3种珊瑚在32℃驯化胁迫3 d后，表面共生虫黄藻密度和暗适应后最大光量子产量都显著降低(p<0.05)；在26 ℃条件下恢复14 d之后，均能恢复到正常水平；在34 ℃驯化验证胁迫3 d，驯化组和高温对照组珊瑚的表面共生虫黄藻密度和暗适应后最大光量子产量(p<0.05),但是驯化组的值显著高于高温对照组的值；三种造礁石珊瑚的共生虫黄藻密度变化趋势与共生虫黄藻最大光量子产量的变化趋势一致。

图3 三种珊瑚在高温胁迫过程中共生虫黄藻密度(Ⅰ)和暗适应后最大光量子产量(Ⅱ)的变化

2.3 Capspase-3酶活性变化

如图4所示，三种造礁石珊瑚在受到高温胁迫时Capspase-3酶活性升高，其中驯化组的澄黄滨珊瑚和鹿角杯形珊瑚比高温对照组的这两种珊瑚中Capspase-3酶活性存在显着差异(p<0.05)，十字牡丹珊瑚总的来看并没有特别明显的变化；三种造礁石珊瑚在受到同样的高温胁迫时，虽然Capspase-3酶活性都有上升，但是三种造礁石珊瑚Capspase-3酶活性上升程度差别很大，十字牡丹珊瑚Capspase-3酶活性并没有显著性差异。

图4 三种珊瑚在高温胁迫过程中Capspase-3活性的变化

C: 空白对照组(26 ℃); A: 驯化组第一次取样(32 ℃胁迫3 d); RA: 驯化组第二次取样(32 ℃胁迫3 d后26 ℃恢复14 d); H: 高温对照组(34 ℃ 3 d, 鹿角杯形珊瑚为34 ℃ 2 d); RH: 驯化组第三次取样(32 ℃胁迫3 d后26 ℃恢复14 d, 又升至34 ℃持续3 d; 鹿角杯形珊瑚为34 ℃ 2 d). 误差线为三次重复的平均值的标准误差。通过SPSS分析，不同字母标注的为参数有显着差异(p<0.05)。

C: 空白对照组(26 ℃); A: 驯化组第一次取样(32 ℃胁迫3 d); RA: 驯化组第二次取样(32 ℃胁迫3 d后26 ℃恢复14 d); H: 高温对照组(34 ℃ 3 d, 鹿角杯形珊瑚为34 ℃ 2 d); RH: 驯化组第三次取样(32 ℃胁迫3 d后26 ℃恢复14 d, 又升至34 ℃持续3 d; 鹿角杯形珊瑚为34 ℃ 2 d). 误差线为三次重复的平均值的标准误差。通过SPSS分析，不同字母标注的为参数有显着差异(p<0.05)。

2.4 种间差异

三种造礁石珊瑚在直接受到34℃胁迫后，如表1所示，虫黄藻密度、暗适应后最大光量子产量和Capspase-3酶活性都有明显差异。三种造礁石珊瑚中，鹿角杯形珊瑚损失的虫黄藻数量最多，Fv/Fm下降百分比；澄黄滨珊瑚和十字牡丹珊瑚损失虫黄藻数量和Fv/Fm下降百分比相差较小， Capspase-3酶活性上升百分比澄黄滨珊瑚最大而十字牡丹珊瑚最小。如图2所示，鹿角杯形珊瑚已经开始组织脱落，白化死亡；澄黄滨珊瑚和十字牡丹珊瑚并没有组织脱落、死亡的现象。

图2 三种珊瑚在高温胁迫过程中的表现变化

表1 三种珊瑚耐热性差异

三种造礁石珊瑚进行34℃驯化验证胁迫时，如表2所示，三种造礁石珊瑚驯化组与高温对照组相比：澄黄滨珊瑚的虫黄藻数量、Fv/Fm值和Capspase-3酶活性相差均为最大；十字牡丹珊瑚的虫黄藻数量相差最小，Capspase-3酶活性相差最小；鹿角杯形珊瑚的Fv/Fm值相差最小。

表2 三种珊瑚驯化效果差异

3 讨论

3.1 三种造礁石珊瑚对高温胁迫的响应及差异

珊瑚共生体虫黄藻密度、暗适应后最大光量子产量和半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)都是指示珊瑚健康状态的重要指标。珊瑚在受到高温胁迫时，珊瑚虫体内的虫黄藻会发生细胞凋亡、坏死等现象，受损的虫黄藻被珊瑚虫驱逐[19]。从而导致珊瑚的虫黄藻密度降低，直至珊瑚白化死亡。热胁迫也会导致虫黄藻光合系统电子转移受阻、D1蛋白遭破坏和活性氧增加，从而降低共生虫黄藻最大光量子产量[19]。当珊瑚受到胁迫时会产生活性氧等有毒物质，从而引起珊瑚的细胞凋亡程序启动，促使珊瑚白化死亡，Caspase-3就是凋亡过程中的关键效应蛋白酶[19]。

在34 ℃胁迫时，鹿角杯形珊瑚损失虫黄藻最多，最先出现组织脱落、死亡的现象，但是其Fv/Fm下降比例却最小；澄黄滨珊瑚和十字牡丹珊瑚虫黄藻损失数量和Fv/Fm下降比例相近，但caspase-3酶活性上升比却相差甚远。由此可以得出不同种造礁石珊瑚的耐热性不同。

本课题组李杨[20]的研究显示，滨珊瑚共生虫黄藻亚系群多样性较低，种内占绝对优势的是C15亚系群；十字牡丹珊瑚中C1亚系群虫黄藻丰度占绝对优势；鹿角杯形珊瑚中虫黄藻亚系群多样性较丰富，其中C1亚系群分布最广，也有部分鹿角杯形珊瑚中D1亚系群相对丰度最高。Rowan[21]等研究表明C型虫黄藻光生理功能较强，但是容易受到外界条件干扰，D型虫黄藻的光生理功能更稳定，更有利于珊瑚受损后的光生理功能恢复。Robison[22]等人研究表明不同种类虫黄藻光生理具有差异性，即使同种虫黄藻的不同系群之间也有差异。所以，造成上述现象的原因可能是三种珊瑚的共生虫黄藻系群差异的原因。

3.2 适度驯化对三种造礁石珊瑚热耐受性的影响及差异

本研究发现，经过室内短期驯化后，从表型上看，鹿角杯形珊瑚有较好的驯化效果，澄黄滨珊瑚次之，十字牡丹珊瑚效果不明显。通过珊瑚健康指标来看，三种造礁石珊瑚在经历过驯化胁迫后，珊瑚共生体虫黄藻密度、暗适应后最大光量子产量都显著高于高温对照组，澄黄滨珊瑚和鹿角杯形珊瑚的驯化组Capspase-3酶活性显著低于高温对照组。这些实验结果显示，适度的热胁迫可以提高造礁石珊瑚对极端高温的热耐受性。Rachael[15]等人也发现经过室内31 ℃热驯化48 h的矛枝鹿角珊瑚暗适应后最大光量子产量和虫黄藻密度显著高于未驯化组。Konstantin[23]对马尔代夫最北端的环礁Ihavan dippolu研究也显示，在1998年珊瑚大规模白化事件中幸存下来的珊瑚礁，在2010年珊瑚大规模白化事件中受到的破坏较小，且正在缓慢恢复且仍保持着相当高的生存发展潜力。

通过对三种造礁石珊瑚的驯化组和高温对照组在34 ℃驯化验证胁迫时的生理指标分析，三种珊瑚的共生体虫黄藻密度、暗适应后最大光量子产量和Capspase-3酶活性变化幅度不一致，由此可见适度的热胁迫虽然可以提高造礁石珊瑚对极端高温的热耐受性，但是对不同种珊瑚的驯化效果不同。Berkelmans[24]等人研究显示，同一种形态、不同种珊瑚对于温度的耐受性也存在差异性。因此，造成不同种珊瑚在相同条件下热耐受性不同和适度热胁迫对三种造礁石珊瑚的热耐受性影响不同的原因可能为虫黄藻系群的不同。虫黄藻系群之间耐受性的差异以及三种造礁石珊瑚之间Capspase-3酶活性相差较大的原因还需进一步研究。基于表型观察和基于指标参数测定的结果不一致，可能是因为不同种珊瑚的热耐受性差异导致。

有报道称如果环境质量不加以改善或继续恶化，大部分珊瑚礁有可能于本世纪中期消失[25]。这种推论都是在珊瑚热耐受力不变的假设下提出的，并没有考虑到珊瑚的短期适应力。本研究发现适度的热胁迫可以提高造礁石珊瑚对极端高温的热耐受性。考虑到珊瑚本身的短期热驯化能力，在全球气候变暖的背景下，珊瑚礁的命运或许并没有那么悲观。当然，这也取决于珊瑚的耐热性提高的速度是否能够跟上全球气候变暖的速度。本研究还发现，不同种的珊瑚的热耐受能力和短期热驯化能力不同，因此持续变暖可能会导致珊瑚群落中耐受能力弱的种属白化死亡，最终导致全球珊瑚多样性减少。

珊瑚的人工繁育和生态修复移植是目前解决全球变暖背景下珊瑚礁生态系统不断退化问题的主要出路之一[26-28]。但是有的学者认为珊瑚礁生态修复之后，仍不能在全球气候变暖的背景下存活太久[29]。本研究通过对不同种造礁石珊瑚进行室内短期驯化研究发现，对珊瑚苗种进行短期热胁迫驯化后再进行生态修复移植，可以在一定程度上增强珊瑚耐热能力，为全球气候变暖背景下的珊瑚礁生态修复提供理论依据。