左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层IR/IRS-1信号通路和能量代谢的影响

杨蕙，朱青，李薇，雷诗卉，刘检，孟盼，刘林，肖望重，王宇红

1.湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验中心，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；3.湖南省肿瘤医院，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南 长沙 410013

2020年发布的《中国居民营养与慢性病状况报告》显示，我国糖尿病患病率为11.9%，抑郁症患病率为2.1%。临床研究显示，糖尿病与抑郁症之间存在双向诱发风险，但诱发因素和机制仍存在较多争议。胰岛素抵抗是糖尿病的典型病理特征，而针对肥胖型抑郁症患者的临床研究发现，胰岛素抵抗的严重程度与患者的抑郁状态呈正相关。糖尿病不仅会导致外周胰岛素抵抗，也会导致中枢胰岛素抵抗。胰岛素在中枢具有多种神经调节功能，其可通过作用于胰岛素受体（IR）参与调控能量代谢等过程和情绪、认知等神经行为。其中，神经元的能量代谢是细胞所有活动的基础。研究认为，胰岛素抵抗可通过影响葡萄糖转运体（GLUT）的膜表达，干扰神经元的能量代谢。

左归降糖解郁方是在经典名方左归丸基础上化裁而成。前期研究发现，左归降糖解郁方可通过调节海马、下丘脑胰岛素信号改善糖尿病并发抑郁症大鼠外周胰岛素抵抗。研究还认为，左归降糖解郁方对下丘脑胰岛素信号的调节与其调控外周糖代谢相关度较高，而对海马胰岛素信号的调节则与改善动物抑郁样行为和认知功能有关。前额叶皮层是 IR高表达的另一脑区，也是与抑郁症密切相关的脑区之一。本实验研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层 IR/IRS-1信号通路和能量代谢的影响，从而进一步丰富左归降糖解郁方对多脑区调节的作用特点。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠48只，体质量190～210 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。动物饲养于湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验中心SPF级动物房，自由摄食饮水，实验前适应性喂养3 d。

1.2 药物

左归降糖解郁方（黄芪、贯叶连翘、姜黄、熟地黄、山萸肉、枸杞子、菟丝子、杜仲、丹参、牡丹皮、牛膝），饮片购于湖南中医药大学第一附属医院，并由医学创新实验中心制成原药材浓度为1.14 g/mL水煎液（黄芪甲苷≥30 μg/mL、姜黄素≥0.4 mg/mL、贯叶金丝桃素≥18 μg/mL、丹酚酸B≥1.2 mg/mL、丹皮酚≥0.2 mg/mL）。动物造模用高脂乳剂（含10%胆固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%猪油、2%胆酸钠、20%聚山梨酯 80和 20%丙二醇），医学创新实验中心制备，批号 20200306，-20 ℃冰箱保存，临用前水浴加热融化。

1.3 主要试剂与仪器

胰岛素受体拮抗剂（S961 TFA），上海MCE公司，批号68525；链脲佐菌素（STZ），北京Solarbio公司，批号 1012C031；胰岛素受体底物-1（IRS-1）、GAPDH、Na,K-ATPase α1抗体，美国CST公司，货号分别为2382、7074、3010；p-IR、IR、p-IRS-1、GLUT4 抗体，江苏 Affinity Biosciences公司，货号分别为AF3099、AF6099、AF4424、AF5386；葡萄糖、丙酮酸 ELISA检测试剂盒，南京建成生物工程公司，货号分别为F006、A081；胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）ELISA检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号分别为206021、201651；超敏ECL试剂盒，苏州新赛美生物科技有限公司，批号 20201201。ChemiDoc XRS+凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；SMART动物行为学检测系统，美国东乐自然基因生命科学公司；Enspire多功能酶标仪，美国PerkinElmer公司。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

采用2周高脂乳剂灌胃（10 mL/kg）、一次性STZ（38 mg/kg）尾静脉注射和4周慢性温和不可预知应激的联合造模方法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。48只大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（二甲双胍0.18 g/kg＋氟西汀1.8 mg/kg）组、左归降糖解郁方高（20.52 g/kg）、中（10.26 g/kg）、低（5.13 g/kg）剂量组，每组8只。给药剂量根据人与大鼠体表面积换算，相当于60 kg成人用药量的2、1、0.5倍，灌胃体积 10 mL/kg，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次，连续4周。给药结束后禁食不禁水12 h，尾尖采血测量大鼠空腹血糖，随后进行行为学实验。

2.2 旷场实验

旷场实验主要观察动物的自主活动行为和探究行为。实验前将敞箱（80 cm×80 cm×40 cm）底部划分为25个面积相等的方格。实验时依次将大鼠从同一位置放入敞箱中并适应1 min，记录大鼠3 min内活动次数。大鼠每经过1个方格或攀爬在箱壁上均记为1次活动。每只大鼠测评结束后，用消毒纸巾擦拭箱体，以免气味相互干扰。实验过程中保持房间内光线一致且安静。

2.3 强迫游泳实验

强迫游泳实验用来评价大鼠的抑郁样行为。将大鼠置于高40 cm、直径20 cm的圆柱形玻璃缸内，缸中水位以大鼠伸展全身而尾部不碰触缸底为准，将大鼠放入缸内适应1 min，记录大鼠在3 min内的不动时间（以大鼠漂浮在水面且四肢不动或四肢轻微划水为静止不动）。实验中注意保证同期实验大鼠之间不可见，以减少干扰。

2.4 血清胆固醇和三酰甘油含量检测

行为学检测后，所有大鼠禁食过夜，次日上午以戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，1 200 r/min离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测血清TC和TG含量。

2.5 葡萄糖代谢检测

取血后颈椎脱臼法处死大鼠并于冰上取脑，分离前额叶皮层组织于液氮中速冻，随后转移至-80 ℃冰箱保存。实验前将前额叶皮层置于冰上快速匀浆，4 ℃、1 200 r/min离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测葡萄糖和丙酮酸含量。

2.6 Western blot检测

将样品分别用不同蛋白提取液处理，总蛋白提取液用于检测IR、p-IR、IRS-1、p-IRS-1蛋白表达，膜蛋白提取液用于检测GLUT4蛋白表达。BCA法测定蛋白浓度，依次对蛋白进行变性、凝胶电泳、湿式转膜，脱脂牛奶室温封闭1 h，加入稀释的GLUT4（1∶2 000）、p-IR（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、IR（1∶2 000）、IRS-1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）和 Na,K-ATPase α1（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3 000），室温孵育1 h，洗膜，ECL试剂显色，采用Image J软件对蛋白条带进行分析。

3 统计学方法

4 结果

4.1 左归降糖解郁方对模型大鼠血糖、血脂的影响

与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖、血清 TC和TG含量显著增加（＜0.01，＜0.05）；与模型组比较，左归降糖解郁方高、中剂量组大鼠空腹血糖、血清TC和TG含量显著减少（＜0.01，＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠血糖、血脂含量比较（±s，mmol/L）

4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠抑郁样行为的影响

与对照组比较，模型组大鼠强迫游泳实验不动时间显著延长，旷场实验活动次数显著减少（＜0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组大鼠强迫游泳实验不动时间明显缩短，旷场实验活动次数明显增加（＜0.01），左归降糖解郁方中剂量组大鼠强迫游泳实验不动时间明显缩短（＜0.05），旷场实验活动次数无明显变化（＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠强迫游泳实验和旷场实验抑郁样行为比较（±s）

4.3 左归降糖解郁方对模型大鼠前额叶皮层能量代谢的影响

与对照组比较，模型组大鼠前额叶皮层葡萄糖含量显著增加，丙酮酸含量显著减少（＜0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组大鼠前额叶皮层葡萄糖含量明显减少，丙酮酸含量明显增加（＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠前额叶皮层葡萄糖和丙酮酸含量比较（±s）

4.4 左归降糖解郁方对模型大鼠前额叶皮层胰岛素受体、胰岛素受体底物-1蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠前额叶皮层p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比值显著降低（＜0.01，＜0.05）；与模型组比较，左归降糖解郁方高、中剂量组大鼠前额叶皮层p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比值显著升高（＜0.01，＜0.05）。结果见图1、表4。

表4 各组大鼠前额叶皮层p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比较（±s）

图1 各组大鼠前额叶皮层p-IR、IR、p-IRS-1、IRS-1蛋白免疫印迹

4.5 左归降糖解郁方对模型大鼠前额叶皮层葡萄糖转运体4蛋白膜表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠前额叶皮层 GLUT4蛋白膜表达显著降低（＜0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高、中、低剂量组大鼠前额叶皮层GLUT4蛋白膜表达显著升高（＜0.01）。结果见图2、表5。

图2 各组大鼠前额叶皮层GLUT4蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠前额叶皮层GLUT4蛋白膜表达比较（±s）

5 讨论

近年来有研究提出，脑胰岛素抵抗是糖尿病和抑郁症的共同病理机制。动物实验发现，转基因糖尿病小鼠存在脑胰岛素信号紊乱，并从5月龄开始表现出明显的抑郁样行为。C57BL/6小鼠经高脂饲料喂养后也表现出明显的焦虑和抑郁样行为，且与脑胰岛素信号损伤密切相关。糖尿病诱发的中枢胰岛素抵抗会影响脑神经元存活和中枢能量代谢稳态。中枢胰岛素抵抗的具体表现形式是以 IR/IRS-1为核心的胰岛素信号异常。胰岛素进入脑内后特异性作用于IR，进而诱导IRS-1磷酸化，激活PI3K、MAPK等多条下游信号通路，调节神经能量代谢和突触可塑性等。前额叶皮层功能障碍与大部分情感障碍疾病相关，包括重度抑郁症。但糖尿病并发抑郁症是否存在前额叶皮层胰岛素信号异常，目前并不清楚。本实验发现，糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层p-IR和p-IRS-1表达均显著降低，提示前额叶皮层存在胰岛素抵抗。

GLUT4是葡萄糖转运蛋白家族的成员之一，由12个跨膜片段和1个位于N端的胞外环状结构域组成。与肌肉组织类似，前额叶皮层中的GLUT4同样属于胰岛素敏感性葡萄糖转运蛋白，胰岛素可刺激GLUT4从胞浆转位到细胞膜，并增加神经元对葡萄糖的摄取。本研究发现，模型组大鼠前额叶皮层细胞膜表面GLUT4蛋白表达显著降低，而前额叶皮层中葡萄糖含量显著增加，提示糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层可能存在神经元对葡萄糖的摄取异常，而丙酮酸的含量变化进一步确定了神经元对葡萄糖的摄取和利用异常。此外，推测模型大鼠前额叶皮层葡萄糖含量增加可能是由于糖尿病脑胰岛素抵抗导致葡萄糖消耗减少，堆积增加。

左归降糖解郁方中熟地黄为君，滋养肾阴；山萸肉、枸杞子为臣，合君药以加强滋补肾阴作用；佐以菟丝子、牛膝、杜仲补肝肾，黄芪健脾益气，丹参、牡丹皮活血散瘀，姜黄、贯叶连翘化瘀行气、疏肝解郁。全方共奏疏肝解郁、活血化瘀之功。前期研究发现，左归降糖解郁方可调节糖尿病并发抑郁症大鼠部分脑区的胰岛素信号。故本实验观察该方对大鼠前额叶皮层胰岛素信号的干预作用。结果发现，左归降糖解郁方可提高糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层p-IR、p-IRS-1蛋白表达及GLUT4蛋白的膜表达，推测左归降糖解郁方可通过改善前额叶皮层胰岛素信号，促进GLUT4蛋白由细胞质向细胞膜转位，从而增加神经元的能量利用。此外，左归降糖解郁方降低前额叶皮层葡萄糖含量、增加丙酮酸含量的实验结果为上述结论提供了佐证。同时实验发现，左归降糖解郁方高、中、低剂量对GLUT4的膜表达均有显著影响，故推测该方可能不仅通过改善胰岛素信号促进GLUT4膜转位，其对GLUT4的易位是否还有直接或其他间接作用值得进一步深入研究。

综上所述，左归降糖解郁方可能通过调节大鼠前额叶皮层胰岛素信号，改善神经元的能量代谢水平，从而发挥抗抑郁作用。