余甘子圣女果复合饮料发酵工艺及对运动耐力的影响

郑 聪，李胜楠

（新乡医学院，河南新乡 453000）

余甘子（Phyllanthus emblicaL.）属于大戟科叶下珠属余甘子的果实，富含多糖、黄酮、皂苷及多酚等物质，营养价值丰富，具有良好的抗炎、抗菌、增强机体免疫等效果[1-2]。国、内外学者等先后研究发现高浓度的余甘子多糖对DPPH自由基的清除能力与Vc相当[3]，而对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到80.3%和85.9%[4]；余甘子多酚提取物对ABTS+自由基的半抑制浓度较Vc显著偏低[5]，而对DPPH自由基、羟自由基的清除率和自发性肝脂质氧化的抑制率均明显高于相同浓度的茶多酚[6]；杜丽娟等分别测定余甘子的黄酮提取物对羟自由基、亚硝酸钠及DPPH自由基的清除率为82.72%、66.14%和97.40%，表明其体外抗氧化活性较好[7]。圣女果又称“小番茄”，富含矿物质、维生素及有机酸等营养成分，其果浆香气芬芳浓郁，且其主要成分番茄红素的抗氧化能力优于β-胡萝卜素，具有促进体内物质代谢、增强细胞的抗氧化作用[8-9]。

“运动耐力”是机体可承受的最大运动负荷，高强度运动可使机体肌肉剧烈收缩，诱导体内活性氧与NO浓度水平的升高，促使相关肌蛋白发生超S-亚硝基化，自由基浓度水平上升，造成体内生理环境发生改变，致使各组织、器官供氧不足，出现持续性或重度疲劳，导致运动耐力的下降[10-11]。目前主流的运动饮料多以糖类、盐类物质为主要成分，口感单一，仅可预防剧烈运动后的身体水盐紊乱，不能起到根本的抗疲劳效果。

目前体外补充抗氧化剂已被证实具有较好的抗运动性疲劳效果，且部分已被开发制成食品，而余甘子口感微涩，加工食品多以其粉末、果干或果脯为主，经济附加值较低。本研究以余甘子与圣女果为原料，利用乳酸杆菌发酵，制得余甘子圣女果复合发酵饮料，通过考察不同发酵工艺条件对该复合饮料品质的影响，确定最佳发酵工艺，同时利用动物模型探讨其对运动耐力的影响，以期为相关资源的利用和运动食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

余甘子果实、圣女果 购于新乡牧野农贸市场；发酵乳杆菌 瑞楚生物科技（江苏）有限公司；蔗糖珠海市泛海生物技术有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、苯酚、硫酸、甲醇、乙醇 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、芦根、没食子酸、番茄红素对照品 中国食品药品检定研究院；肝糖原（Liver glycogen, LG）、肌糖原（Muscle glycogen, MG）、乳酸（ Blood lactic acid, BLA）、尿素氮（ Blood urea nitrogen, BUN）检测试剂盒 上海瑞番生物科技有限公司；试验用水为纯化水；SPF级健康雄性昆明小鼠100只，体质量17～25 g，由河南省实验动物中心提供（动物许可证号：SCXK （豫）2017-0001）。

B5002型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；752N型紫外可见分光光度计 上海仪电科技有限公司；U3000型高效液相色谱仪 赛默飞世尔科技有限公司；PS220型果蔬打浆机 诸城市瑞民机械有限公司；DZJR-5型高压均质机 无锡帝硕自动化设备有限公司；VYJG-9420型恒温干燥箱 杭州亿捷科技有限公司；TG16G型离心机 常州亿能实验仪器有限公司；HH-8型数显恒温水浴锅 济南欧莱博技术有限公司；BJPX-200型恒温培养箱 山东博科科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 制备要点

1.2.2.1 余甘子提取液制备 余甘子果实清洗后，去核烘干，粉碎完全后过80目筛，称取一定质量干粉，照料液比1:8 （m/v）加入纯化水，回流提取1 h，离心（5000 r/min）过滤后取上清液，即得[12]。

1.2.2.2 圣女果汁制备 挑选新鲜的圣女果，清水洗净后，去皮榨汁，采用100目滤布过滤，取滤液，即得。

1.2.2.3 调配、均质与灭菌 余甘子提取液与圣女果汁按照一定体积比混合后，添加3%（m/V）蔗糖，经高压均质 （20 MPa、60 ℃）后，于80 ℃灭菌15 min，冷却、备用。

1.2.2.4 接种发酵 采取无菌操作，将活化后的乳酸杆菌 （1×107CFU/mL）接种至灭菌完成的复合饮料中，置于一定的温度下，发酵一段时间后，即得余甘子圣女果复合发酵饮料[13]。

1.2.3 单因素实验考察 根据预实验结果，选择乳酸菌接入量、余甘子提取液与圣女果汁的体积比、发酵温度及时间为考察因素，具体如下：固定余甘子提取液与圣女果汁的用量体积比1:3、发酵温度40 ℃、发酵时间30 h，考察不同乳酸菌接入量 （0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）对饮料感官评分的影响；固定乳酸菌接入量0.5%，发酵温度40 ℃、发酵时间30 h，考察不同余甘子提取液与圣女果汁的用量体积比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）对饮料感官评分的影响；固定余甘子提取液与圣女果汁的用量体积比1:3、乳酸菌接入量0.5%、发酵时间30 h，考察不同发酵温度 （25、30、35、40、45 ℃）对饮料感官评分的影响；固定余甘子提取液与圣女果汁的用量体积比1:3、乳酸菌接入量0.5%、发酵温度40℃、考察不同发酵时间 （24、30、36、42、48 h）对饮料感官评分的影响。

1.2.4 响应面优化 基于1.2.3单因素实验结果，利用Box-Benhken试验设计对复合饮料制备的关键条件，即余甘子提取液与圣女果汁的用量体积比、乳酸菌接入量、发酵温度和时间进一步优化，响应面试验因素及水平见表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.5 饮料理化与微生物指标检测

1.2.5.1 pH测定 采用pH计测定饮料pH。

1.2.5.2 总多糖含量 以葡萄糖标准品作对照，于490 nm波长处测定吸光度，采用苯酚-硫酸法测定饮料的多糖含量[14]。

1.2.5.3 总黄酮含量测定 以芦丁标准品作对照，于510 nm波长处测定吸光度，采用亚硝酸钠-硫酸铝法测定饮料的黄酮含量[15]。

1.2.5.4 总多酚含量测定 以没食子酸标准品作对照，于765 nm波长下测定吸光度，采用福林酚法测定饮料的总多酚含量[16]。

1.2.5.5 番茄红素含量 参照文献[17]所述步骤，采用C18作为固定相的色谱柱，在甲醇-乙酸乙酯（95:5）的流动相下等度洗脱，于472 nm检测波长下测定饮料的番茄红素含量。

1.2.5.6 乳酸菌量测定 照GB/T 4789.35-2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定饮料的乳酸菌量[18]。

1.2.6 饮料感官评价标准 通过观察余甘子圣女果复合发酵饮料的性状，并参考其它饮料评价标准[19]，制定该复合发酵饮料的感官评价标准，见表2所示。挑选10名饮料感官评价经验丰富人员，按照该标准要求，分别对不同工艺制备的饮料“色泽”、“气味”、“口感”与“组织形态”进行评价，所以评价分数均去掉最高分与最低分后取平均值。

表2 复合发酵饮料感官评价标准Table 2 Criterion of sensory evaluation on compound fermentation beverage

1.2.7 运动耐力影响评价

1.2.7.1 动物分组与剂量设计 100只小鼠经适应性喂养5 d后，按体质量随机分为空白对照组、对照组和饮料的低、中、高剂量组，照《保健食品功能评价》要求，三个饮料组小鼠的每日灌胃量，分别给予10、20、30 mL/kg，而空白对照组按照20 mL/kg灌胃0.85%生理盐水，对照组则按照相同剂量灌胃3%蔗糖溶液，所有小鼠每日灌胃1次，连续30 d[20]。

1.2.7.2 爬杆试验 末次灌胃结束，休息30 min后，选取各组10只小鼠置于爬杆中，记录小鼠自肌肉紧张抱紧爬杆至无力脱落的时间[21]。

1.2.7.3 体内生化指标检测 末次灌胃30 min后，选取各组剩余小鼠置于水中（温度：30±2 ℃）游泳30 min，取出，休息10 min，眼眶采血离心，照血乳酸、尿酸氮检测试剂盒使用说明，检测血清中BLA、BUN含量，同时取出肝脏与后腿肌肉，漂洗、吸干后，利用肝糖原、肌糖原检测试剂盒测定LG、MG含量[22]。

1.3 数据处理

通过SPSS19.0软件分析试验结果并进行方差分析，比较组间差异，当P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乳酸菌接种量对饮料品质的影响 图1为不同乳酸菌的接种量对复合发酵饮料感官评分与总酸含量的影响，从图1可见，随着乳酸菌接种量的增多，饮料的感官评分与总酸含量均先升高后降低，当乳酸菌接种量至0.5%时，饮料的感官评分最高达到83.7分，且总酸含量适宜。这归因于接种量的高低直接影响乳酸菌的繁殖基数，当接种量偏低时，乙醇与有机酸的产率偏低，但接种量过多，基质中糖类物质消耗过快，使得发酵液中有机酸含量的增加过多，既影响饮料的口感也抑制乳酸菌的活性，从而不利于发酵，这与李昌宝等研究圣女果百香果复合发酵饮料的乳酸菌添加量结果相似[23]，因此选择0.3%、0.5%、0.7%作为后续响应面试验中乳酸菌接种量的考察水平。

图1 乳酸接种量对复合发酵饮料感官评分与总酸含量的影响Fig.1 Effects of inoculum on sensory score and total acid content of compound fermented beverage

2.1.2 余甘子提取液与圣女果汁体积比对饮料品质的影响 图2为余甘子提取液与圣女果汁的体积比对复合发酵饮料的感官评分与总酸含量影响，从图2可知，复合发酵饮料的感官评分随着余甘子提取液与圣女果汁体积比的增多呈先增大后减小的趋势，总酸的含量则不断减小，当余甘子提取液与圣女果汁的体积比为1:3时，复合发酵饮料的感官评分达到最高。这归因于随着圣女果汁的用量增多，饮料的色素浓度增大，含糖量升高，有助于“色泽”与“口感”项评分提高，但缺失余甘子的酸甜风味，其有机酸含量也逐步下降，因此选择1:2、1:3、1:4作为后续响应面试验中余甘子提取液与圣女果汁的体积比考察水平。

图2 余甘子提取液与圣女果汁体积比对复合发酵饮料感官评分与总酸含量的影响Fig.2 Effects of ratio of Phyllanthus emblica extract and cherry tomato juice on sensory score and total acid content of compound fermented beverage

2.1.3 发酵温度对饮料品质的影响 发酵温度影响乳酸菌的生长速度，因此分别考察不同发酵时间对复合发酵饮料的感官评分与总酸含量的影响，结果见图3。从图3可知，随着发酵温度的升高，复合饮料的感官评分与总酸含量均先增大后较小，当发酵温度为40 ℃时，饮料的感官评分达到最高，这归因于当发酵温度过低，发酵速度较缓慢，影响饮料的口感，这与张婉滢等考察胡萝卜乳酸饮料的发酵温度结果相近[24]，因此选择35、40、45 ℃作为后续响应面试验中发酵温度的考察水平。

图3 发酵温度对复合发酵饮料感官评分与总酸含量的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on sensory score andtotal acid content of compound fermented beverage

2.1.4 发酵时间对饮料品质的影响 发酵时间的长短影响乳酸菌的产酸量，从而影响饮料的风味，因此分别考察不同发酵时间对复合发酵饮料的感官评分与总酸含量影响，结果见图4。从图4可知，当发酵时间为30 h，复合饮料的感官评分达到最高，随后逐渐下降，而总酸含量升高缓慢。这归因于在发酵初始阶段，乳酸菌利用基质中的糖类物质快速生成乳酸，对饮料的风味具有一定的提升作用，但随着发酵时间的延长，乳酸菌的活性开始降低，同时大量乳酸的累积将抑制发酵过程，这与庞庭才等研究小球藻红枣乳酸发酵饮料的结果基本一致[25]，因此选择24、30、36 h作为后续响应面试验中发酵时间的考察水平。

图4 发酵时间对复合发酵饮料感官评分与总酸含量的影响Fig.4 Effects of fermentation time on sensory score and total acid content of compound fermented beverage

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 Box-Behnken试验设计与方差分析 采取Box-Behnken试验设计，以乳酸菌接种量、余甘子提取液与圣女果汁体积比、发酵温度及时间为考察因素，进行四因素三水平响应面优化试验，试验结果与方差分析见表3、表4所示。

表4 响应面方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment

采用Design-Expert 8.0.6软件对表3结果进行二次回归方程拟合，得到感官评分对各因素水平的二次多项回归方程：Y=85.42+2.10A+1.87B+5.28C-1.34D-2.82AB+0.075AC+0.05AD-2.58BC+2.55BD+1.57CD-5.39A2-3.93B2-2.47C2-4.2D2。

表3 响应面试验结果Table 3 Results of the response surface experiment

从表4可知，该回归模型具有极显著性（P＜0.01），决定系数为0.9896，失拟项不显著（P＞0.05），表明该模型方程可准确反映各因素与响应值的变化关系。从显著性分析可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、D2对复合饮料的感官评分影响均极显著（P＜0.01），一次项D，二次项C2，交互项AB、BC、BD对复合饮料的感官评分影响均显著（P＜0.05），各因素在考察的水平范围内对复合饮料的感官评分影响顺序为：发酵温度（C）＞乳酸菌接种量（A）＞原料体积比（B）＞发酵时间（D）。

2.2.2 响应面交互作用分析与最佳发酵条件确定图5为不同考察因素之间相互作用的响应曲面，从图5可知，在AB、BC、BD的交互曲面中，曲面陡峭，表明两因素之间交互作用显著（P＜0.05），且随着各因素水平的增加，饮料的感官评分均呈先升高后下降的趋势，而在AC、CD、AD的交互曲面中，感官评分随着各因素水平的增加升高缓慢，两因素之间交互作用不显著（P＞0.05）。通过Design-Expert 8.0.6软件拟合得出余甘子圣女果复合饮料的最佳发酵工艺为：乳酸菌接种量0.55%、余甘子提取液与圣女果汁的体积比1:2.86、发酵温度45 ℃、发酵时间29.83 h，感官评分预测值88.6分。但为后续操作方便，修改工艺条件为：乳酸菌接种量0.6%、余甘子提取液与圣女果汁的体积比1:3、发酵温度45 ℃、发酵时间29.8 h。在此工艺条件下，饮料的感官评分为88.2分，与预测值较接近，表明该回归模型预测性较好。

图5 两因素交互作用的响应曲面Fig.5 Response surface of interaction between each two factors

2.3 复合饮料的品质分析

2.3.1 感官结果 采用最佳发酵工艺制得的余甘子圣女果复合发酵饮料呈红色，色泽均一、透亮，富有余甘子与圣女果的混合香味、酸甜适宜，口感细腻，静置未有明显分层。

2.3.2 理化与微生物结果 采用最佳发酵工艺制得的余甘子圣女果复合发酵饮料的理化与微生物指标测定结果，见表5所示。从表5可知，该复合发酵饮料pH适宜，多糖、黄酮、多酚、番茄红素及乳酸菌的含量较高，营养价值丰富，乳酸菌含量≥106，符合GB 7101-2015 食品安全国家饮料标准要求。

表5 复合发酵饮料的品质结果Table 5 Results of quality indexes of compound fermented beverage

2.4 复合饮料对小鼠爬杆时间影响

动物的爬杆时间长短可间接反映其运动耐力，表6为不同组别的小鼠爬杆时间，与空白对照组和对照组相较，不同组别小鼠的爬杆时间均有延长，且具有极显著性差异（P＜0.01），其中低、中、高剂量组的爬杆时间较空白对照组分别延长5.1、8.3、10.7 min，表明余甘子圣女果复合发酵饮料有助于增强动物的运动耐力，延长其运动时间；同时低、中、高剂量组的爬杆时间较对照组分别延长4.3、7.5、9.9 min，表明饮料中其它组分不影响主成分对动物运动耐力的影响，这与刘媛媛研究人参不老莓复合饮料的抗疲劳功能结果相近[26]。

表6 不同组别小鼠的爬杆时间Table 6 Climbing time of mice in different groups

2.5 复合饮料对运动后小鼠MG、LG含量影响

体内的糖类物质主要以血糖、肝糖原、肌糖原形式存在，为机体运动提供能量[27]，由于体内糖原含量的高低影响机体的运动耐力，为此分别考察复合发酵饮料对运动后不同组别小鼠体内MG、LG含量的影响，结果见表7。与空白对照组相较，各剂量组小鼠运动后体内的MG、LG含量均明显较高，而各剂量组小鼠运动后体内的MG、LG含量较对照组也明显提高，差异显著（P＜0.05，P＜0.01），这主要归因于余甘子与圣女果中多糖可以动物多糖形式存在于小鼠肝脏与肌肉中，为其运动代谢提供能量，这与王书全等研究螺旋藻多糖的抗运动疲劳结果一致[28]，因此余甘子圣女果复合发酵饮料有利于提高体内肝、肌糖原的储备，保持运动后机体的糖原含量。

表7 不同组别小鼠运动后体内MG、LG含量Table 7 Contents of MG and LG of mice in different groups after swimming

2.6 复合饮料对运动后小鼠BLA、BUN含量影响

机体运动过度时，肌肉收缩加剧，致使供氧不足发生糖酵解反应生成乳酸，继而体内环境pH下降，引发其他等生化反应，出现疲劳感，同时糖类、脂肪的过度消耗，致使蛋白质、氨基酸分解，体内血清中BUN含量升高[29]，因此考察不同组别小鼠运动后BLA、BUN含量，结果见表8。从表8可知，与空白对照组、对照组相较，各剂量组小鼠运动后体内的BLA、BUN含量均明显减小，具有极显著性差异（P＜0.01），表明余甘子圣女果复合发酵饮料有助于加快乳酸代谢，减少运动时体内的蛋白质与氨基酸分解。

表8 不同组别小鼠运动后体内MG、LG含量Table 8 Contents of MG and LG of mice in different groups after swimming

3 结论

本研究采用余甘子提取液与圣女果汁为原料，经调配、均质、灭菌后，利用乳酸菌发酵制得余甘子圣女果复合发酵饮料。通过单因素与响应面试验确定该复合发酵饮料的最佳工艺条件为：乳酸菌接种量0.6%、余甘子提取液与圣女果汁的体积比1:3、发酵温度45 ℃、发酵时间29.8 h，感官评分达到88.2分，所得饮料呈红色，色泽均一、透亮，富有余甘子与圣女果的混合香味、酸甜适宜，口感细腻，静置未有明显分层，富含多糖、黄酮、番茄红素等物质，营养价值较高。动物实验结果表明，余甘子圣女果复合发酵饮料有助于延长小鼠的爬杆时间，提高体内肝、肌糖原的储备，并可加快乳酸代谢，减少蛋白质与氨基酸的分解，因此有利于提高机体的运动耐力，可推广用于相关食品领域。