膀胱癌患者癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达与疾病进展及复发的关系

秦建文，张楠，刘小林，陈苏杭，周和平

(中国科学院国科医疗江油医院泌尿外科，四川 江油 621701)

膀胱癌属于泌尿系统高发恶性肿瘤，有调查[1]显示，在成人恶性肿瘤中，膀胱癌约占8%左右。研究膀胱癌进展与复发机制，对指导临床诊治，降低患者复发率、改善预后具有重要意义。纤蛋白3(Fibulin-3)属于细胞外基质中的糖蛋白，在人体广泛表达[2-3]。有研究[4]表明，细胞外基质中Fibulin-3起着构架作用，并可作用于下游信号通路，激活表皮生长因子受体信号通路。多种实体瘤患者肿瘤组织Fibulin-3异常表达，具有肿瘤促进作用[5]。SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)可对肿瘤血管形成产生重要调控作用，参与肿瘤发生与发展[6]。核受体辅激活因子1(NCOA1)为依赖配体的相应转录因子，在多种病理组织中呈现高表达水平，可能参与肥胖、癌症以及糖尿病病理[7]。本文旨在探究膀胱癌患者癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达情况与疾病进展及复发的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月至2017年3月中国科学院国科医疗江油医院收治的104例膀胱癌患者的癌组织和癌旁组织为研究对象。纳入标准：(1)具有手术适应症，并接受根治性全膀胱切除术；(2)病理证实为膀胱癌；(3)临床资料完整；(4)精神、意识正常，签署研究知情同意书。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾等疾病；(2)其他恶性肿瘤患者；(3)具有传染病史。本研究经医院医学伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 包括性别、年龄、体重指数(BMI)、肿瘤直径、TNM分期、病理分级、淋巴结转移、浸润深度及随访3年疾病复发情况。

1.2.2 免疫组化检测 取自手术切除的癌组织与相应配对癌旁(与肿瘤间隔>5 cm)正常组织。石蜡包埋切片，利用柠檬酸盐修复液进行抗原的修复；以3%过氧化氢连续孵育10 min，同时对内源性过氧化物酶进行封闭处理；以山羊血清封闭。接着分别放入Fibulin-3单克隆抗体、SENP1单克隆抗体及NCOA1单克隆抗体，均由Abcam 公司提供，置于4 ℃条件下孵育过夜。第2天以山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(经辣根过氧化物酶进行标记，控制稀释比等于1∶50)处理，室温下连续孵育30 min。二氨基联苯胺(DAB)显色，并以苏木素复染，利用二甲苯进行透明处理。注意以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，用于阴性对照。安排两名病理科医师，通过双盲法独立完成阅片过程。结果评估：在各切片之中随机取五个观察视野(400×)，进行染色评估，并在200个细胞之中，算出阳性细胞所占百分比。染色评分标准：显示淡黄色为1分；显示棕黄色为2分；显示棕褐色为3分；阳性细胞百分比评分标准：百分比<10%为1分；10%<百分比≤50%为2分；50%<百分比≤80%为3分；百分比>80%为4分。染色评分+百分比评分>3分提示阳性表达[8]。

1.2.3 苏木精-伊红(HE)染色 采用10%甲醛固定组织样本，石蜡包埋之后进行HE染色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析与处理。计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；相关性采用Logistic回归模型分析；生存分析采取Kaplan-Meier生存曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌与癌旁组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达比较

膀胱癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性率高于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 膀胱癌与癌旁组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达比较[n(%)]

2.2 不同临床特征患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性率比较

不同性别、年龄、BMI、肿瘤直径患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同TNM分期、病理分级、浸润深度及淋巴结转移情况患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 Logistic单因素与多因素回归分析

Logistic回归分析显示，Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达情况与TNM分期、病理分级、淋巴结转移、浸润深度有关(P<0.05)。见表3。

表2 不同临床特征患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性率比较[n(%)]

续表2

表3 Logistic单因素与多因素回归分析

2.4 Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达与疾病复发的关系

随访发现，104例患者共复发46例(肾盂肿瘤6例、盆腔复发5例、尿道复发3例、远处转移32例，其中远处转移包括肺9例、骨10例、肝6例、腹膜后盆腔淋巴结7例)，中位随访时间29(28～31)个月。Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性患者3年无进展生存率低于表达阴性患者(χ2=12.793、35.840、12.558，P<0.05)。见表4、图1-图3。

表4 复发情况[n(%)]

3 讨论

Fibulins与参与构成人体细胞外基质，当前已知包含七个基因型，Fibulin-3具有调控细胞生长与相关信号转导作用，同时在肿瘤发生及演进中起着重要作用[9]。相关研究[10-11]表明，卵巢癌、神经胶质瘤、宫颈癌以及胰腺癌中Fibulin-3具有过表达表现，且和肿瘤进展、患者不良预后有关，关于作用机制，可能由于Fibulin-3启动子区处于超甲基化状态，造成肿瘤恶化。亦有报道[12]认为，对于膀胱癌而言，Fibulin-3属于前侵入因子。本研究中，相较于癌旁正常组织，膀胱癌组织Fibulin-3阳性率升高(P<0.05)且与肿瘤TNM分期、病理分级、淋巴结转移以及浸润深度紧密相关(P<0.05)，与上述研究观点相符。说明Fibulin-3可能参与膀胱癌的发生及进展，考虑可能与Fibulin-3调控上皮间充质转化、基质金属蛋白酶分泌、血管生成、相关信号通路(包括NOTCH、MAPK以及AKT等)有关[13]。有研究[14]表明，SENP1属于缺氧诱导因子1α(HIF-1α)调控靶基因，SENP1与HIF-1α通过正反馈作用可增加肝癌干细胞特性，加快肝癌产生。以往研究以前列腺癌患者为对象，发现病灶组织里面SENP1呈现为高表达，其参与肿瘤侵袭以及复发；通过抑制SENP1表达，能够影响 HIF-1α与相应信号通路中下游部位基质金属蛋白酶2(MMP-2) 与基质金属蛋白酶9(MMP-9)骨重构作用，从而起到抑制骨转移效果[15]。本研究中，膀胱癌组织SENP1阳性率高于癌旁正常组织(P<0.05)；Logistic分析发现，其与肿瘤浸润深度、分期、淋巴结转移及病理分级有关(P<0.05)，表明SENP1可能具有促进膀胱癌进展作用，原因可能和其调控 HIF-1α活性及其下游血管内皮生长因子(VEGF)有关。鉴于SENP1、Fibulin-3均能够调控血管生成，故考虑两者在膀胱癌进展中可能具有协同作用。HIF1α可能通过结合以及激活转录因子NCOA1的方式，调控C-X-C趋化因子受体4，从而加快肿瘤转移[16]，推测SENP1与NCOA1共同参与肿瘤侵袭及转移。有报道[17]显示，膀胱癌患者NCOA1蛋白表达水平和临床分期、是否出现淋巴结转移等存在显著相关性。本研究显示，膀胱癌组织NCOA1阳性率异常升高(P<0.05)，并和肿瘤分期、淋巴结转移情况有关(P<0.05)，与上述研究观点一致，并创新性发现NCOA1和膀胱癌病理分级及浸润等进展密切相关。NCOA1能够通过提高雄激素受体(AR)活性的方式介导细胞增殖，对其进行敲除，可以减少雄激素依赖的相应细胞(如LNCap细胞)增殖，同时对AR依赖细胞(如C4-2细胞)生长产生抑制作用[18]。

以往关于不同Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达膀胱癌患者生存分析的研究极少。本研究经生存分析创新性发现，Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性患者3年无进展生存率明显更低(P<0.05)，提示Fibulin-3、SENP1、NCOA1阳性膀胱癌患者存在更高疾病进展与复发风险。

综上，相较于正常组织，膀胱癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1阳性率更高，且和疾病进展与复发紧密相关，其检测对患者疾病诊治及预后评估具有重要指导价值。但本研究具有一定局限性，比如样本量较少，为单中心研究，且仅采用免疫组化分析法，方法有限，关于Fibulin-3、SENP1与NCOA1参与膀胱癌进展与复发具体分子机制，有待后续大样本、多检测方式及多中心研究进一步探究、补充与完善。