基于网络药理学研究黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的作用机制

张立宏 张声生 谭海成 常雄飞

摘要 目的：運用网络药理学技术研究黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的主要活性成分，预测活性成分的作用靶点、建立“药对-活性成分-疾病-作用靶点”网络，探讨黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的潜在作用机制。方法：运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选黄连-黄柏药对的化学成分，借助人类基因数据库获取溃疡性结肠炎的相关靶点基因，将药物作用靶点及疾病相关靶标基因取交集，使用STRING数据库对关键作用靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过Cytoscape软件将结果可视化，借助DAVID数据库对“黄连-黄柏”治疗溃疡性结肠炎相关靶基因基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：经过筛选出黄连-黄柏药对主要关键靶点蛋白34个和分子信号通路30个，包含PTGS2、IL6、CXCL8等关键基因及T细胞受体、 核因子κB、NOD样受体、Toll样受体信号通路。结论：黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎是多靶点、多个信号通路共同调节的复杂过程，预测其潜在作用机制为深入研究清热法治疗溃疡性结肠炎的作用机制提供理论依据。

关键词 黄连-黄柏药对;网络药理学;溃疡性结肠炎;信号通路;作用机制

Study on the Mechanism of Action of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri in the Treatment of Ulcerative Colitis Based on Network Pharmacology

ZHANG Lihong1，3，ZHANG Shengsheng2，TAN Haicheng3，CHANG Xiongfei3

（1 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine on-the-job Applicants with the Same Level of Education as Graduate Student，Beijing 100105，China; 2 Digestive Disease Center，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China; 3 Gastroenterology Department，Beijing Shunyi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Beijing 101300，China）

Abstract Objective：To apply network pharmacology research of couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri the main active ingredients in the treatment of ulcerative colitis，prediction of active ingredients targets，establish of“medicine-the active ingredient-disease-targets”，further discusses the couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri potential mechanisms for the treatment of ulcerative colitis.Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology and Analysis Platform was used to screen the chemical constituents of the couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri.The relevant target genes of ulcerative colitis（UC） were obtained with the help of human Gene database，and the key action targets of the couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri in the treatment of ulcerative colitis were obtained by taking the intersection of drug action targets and disease-related target genes.The STRING database was used to construct protein interaction networks for key targets，and the results were visualized by using Cytoscape software.The DAVIDdatabase was used to analyze the functional and metabolic pathways of target genes related to the treatment of ulcerative colitis in the couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri.Results：A total of 34 key target proteins and 30 molecular signaling pathways for the couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri were screened.Main key genes such as PTGS2，IL6，CXCL8，and T cell receptor signaling pathway，NF-κB signaling pathway，NOD-like receptor signaling pathway and Toll-like receptor signaling pathway.Conclusion：The treatment of ulcerative colitis with the couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri is a complex process of multiple targets and multiple signaling pathways.The prediction of the potential mechanism provides theoretical basis for further study of the mechanism of action of the heat-clearing method in the treatment of ulcerative colitis.

Keywords Couple medicine Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri; Network pharmacology; Ulcerative colitis; Signal pathway; Mechanism of action

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.001

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是常见的消化系统疑难疾病之一，其发病原因不明，是一种由遗传背景与环境因素相互作用而产生的疾病，呈慢性的炎症反应状态，病变呈连续性，可累及结肠的不同部位，且临床发病常常以发作、缓解和复发交替[1]。

根据溃疡性结肠炎的临床症状，属于中医“久痢”“痢疾”“肠澼”等范畴。该病的病因病机主要是脾气虚，感受外邪及饮食失调是其诱因[2]。病理性质为本虚标实，病理因素主要由湿邪、热毒、痰浊、血瘀等。该病在活动期多属于实证，主要病机为湿热内蕴，重度以热毒为主，治以清热解毒为主，方剂用白头翁汤加减。黄连-黄柏药对出自白头翁汤（《伤寒论》）。通过查阅文献表明白头翁汤对溃疡性结肠炎小鼠结肠病理有改善作用[3]，清热法在溃疡性结肠活动期及早期使用，其中尤以黄连、黄柏清热燥湿之品为代表，《本草正义》有云“黄连大苦大寒，苦燥湿，寒胜热，能泄降一切有余之湿火……”“黄柏主五脏肠胃中结热，肠痔，止泄痢。”临证中善用二者为药对[4]，且黄连-黄柏药对对溃疡性结肠炎的作用机制尚不明确。

网络药理学是集药理学、生物信息学、系统生物学的一门新学科，通过构建“疾病-基因-靶点-通路-药物”网络从整体角度分析药物与机体疾病之间的作用机制[3]。本研究旨在运用网络药理学方法对黄连-黄柏药对治疗UC的作用机制进行初步探索研究，为日后的临床及基础研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 黄连-黄柏药对的成分信息筛选及汇总 黄连-黄柏药对的主要药物组成是黄连、黄柏，使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology And Analysis Platform，TCMSP）收集上述药物的化学成分及靶点。在TCMSP中，设定药物成分口服生物利用度（OB≥30%），类药性（DL≥0.18）筛选出其药物具有良好口服生物利用度和类药性的活性成分。

1.2 活性成分作用靶点的获取及收集 将整理出的“黄连-黄柏”药物活性成分作用的靶点导入UniProt，筛选出与人类相关的基因并进行整理，得到活性成分作用靶点，使用Cytoscape 3.7.1软件将活性成分-靶点作网络图。

1.3 溃疡性结肠炎的关键靶点的收集 使用GeneCards数据库、OMIM数据库获取与溃疡性结肠炎相关靶点基因，将2个数据库的基因进行去重整合。

1.4 “化合物-靶点-疾病”的网络构建 利用Venny 2.1软件将药物的活性化合物对应的靶点与疾病对应靶点取交集，得到黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的关键靶点。

1.5 关键靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将药物治疗疾病的关键靶点上传至STRING在线数据库平台得到PPI关系，将结果以TSV格式导出再将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化，绘PPI网络，设置网络中节点大小和颜色深浅反映Degree值。

1.6 关键靶点生物过程及通路分析 将关键靶点基因输入DAVID数据库中进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，其中GO分析选择生物过程（BP，Biological Process），细胞组分（CC，Cellular Component）和分子功能（MF，Molecular Function）。

2 结果

2.1 黄连-黄柏药对的活性成分信息 通过TCMSP数据库检索收集黄连、黄柏的化学成分，其中黄连化学成分48个，黄柏化学成分140个，最终得到188个化学成分。通过设定OB≥30%及DL≥0.18筛选，最终得到黄连的潜在活性成分14个，黄柏的潜在活性成分37个，整合去重后得到黄连有效活性成分10个，黄柏有效活性成分25个。见表1。通过TCMSP寻找到黄连的活性成分作用靶点为287个，黄柏的活性成分作用靶点为522个，使用UniProt将活性成分的作用靶点名称导入进行筛选，找出其与人类相关并已证实的基因，黄连的活性靶点对应基因为185个，黄柏的活性成分靶点对应基因为392个，筛选去重后得到207个靶点基因。

2.2 “活性成分-靶点”网络构建分析 将黄连、黄柏的有效活性成分进行编号，发现其共同有效活性成分6个，即图中所示A1-A6，分别是Berberine、Berberrubine、Magnograndiolide、Palmatine、Quercetin、Worenine将黄连、黄柏的有效活性成分35个及其活性成分靶点对应的基因577个导入Cytoscape 3.7.1软件进行网络构建及可视化。见图1。

2.3 溃疡性结肠炎的关键靶点筛选 通过GeneCards平臺收集UC相关靶点基因，搜索到关于UC相关靶点4 812个，通过筛选设置Relevance score≥10.8，获得靶点152个;通过OMIM数据库收集UC相关靶点基因为107个，将2个数据库的基因进行去重整合，共获得224个靶点基因。

2.4 “化合物-靶点-疾病”的网络构建及可视化分析 利用Venny 2.1软件将“黄连-黄柏”的活性化合物对应的207个药物靶点与UC对应的224个疾病靶点取交集，最终得到34个交集靶点基因。见图2。关键靶点具体为IL10，TNF，IL1B，CXCL8，MPO，IL2，IFNG，CRP，TP53，IL4，TGFB1，RELA，ICAM1，PTGS2，AKT1，PPARG，MMP1，MMP9，VEGFA，NOS2，PTGS1，CHEK2，CCL2，DUOX2，CD40LG，F2，IL1A，CCND1，EGF，CDKN1A，HMOX1，SELE，CXCL10。

2.5 “黄连-黄柏”治疗溃疡性结肠炎的关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析 将韦恩图获得的34个药物-疾病共同靶点上传至STRING在线数据库平台得到蛋白互作关系。见图3。设置置信度大于0.4，得到关键靶点蛋白34个，422条边代表了蛋白之间的相互作用，将结果以TSV格式导出再将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化，绘制蛋白相互作用网络。见图4。以Degree数值反映节点的大小，其中度值越大，节点越大。度值排名前10位的有PTGS2、IL6、CXCL8、VEGFA、TNF、MMMP9、AKT1、CCL2、IL10、TP53。

2.6 关键靶点的GO富集分析 对关键靶点基因在DAVID网站中进行GO富集分析。见图5。P<0.05靶点关联的生物过程主要有炎症反应，细胞对脂多糖的反应，蛋白磷酸化的正调控，一氧化氮生物合成过程，对药物的反应，免疫反应，凋亡过程的负调控，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，趋化因子的正调控，生物合成过程中基因表达的正调控，转录的正调控，DNA模板正调控，序列特异性DNA结合转录因子活性正调控，核因子κB活性正调控，脂多糖介导的信号通路，蛋白激酶B信号，负调控细胞增殖等。

2.7 KEGG通路分析 对关键靶点基因在DAVID网站中进行KEGG通路分析。见图6。P<0.05靶点关联的通路主要有肿瘤坏死因子（TNF）信号通路，细胞因子-细胞因子受体的相互作用，低氧诱导因子-1信号通路，T细胞受体信号通路，产生IgA的肠道免疫网络，核因子κB信号通路，NOD样受体信号通路，Toll样受体信号通路等。

3 讨论

溃疡性结肠炎病因不明确，病情迁延难愈且反复发作，具有一定的癌变倾向，近年来我国的发病率呈上升趋势。而临床使用氨基水杨酸、激素等药物治疗，仍是以对症治疗及控制炎症为主，长期疗效并不乐观。本团队在前期临床研究中观察中医药分期治疗溃疡性结肠炎的临床疗效，观察组活动期予以清肠化湿方口服联合灌肠方外治，缓解期予以扶正清肠方口服，若病情复发加用灌肠方，对照组给予美沙拉嗪肠溶片口服治疗，结果中医药分期治疗能有效改善轻、中度患者的临床症状，治疗中后期疗效优于西药且能够改善患者的生命质量[5]，从而肯定了中医药在治疗UC中具有其疗效确切、不良反应少、复发率低等优势。

本研究体现了清热法在UC治疗中的运用，尤其临证中常用黄连-黄柏药对，通过网络药理学数据的挖掘，也为其治疗UC进行系统的预测，为以后的基础研究奠定理论基础，提供思路。

通过网络药理学方法对黄连-黄柏药对研究，结果二者潜在活性成分共35个，共同活性成分包括小檗碱、小檗红碱、非洲防己碱、槲皮素、甲基黄连碱，提示这些成分是黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的有效活性成分。其中小檗红碱是小檗碱的活性代谢产物，小檗碱通过调节核因子κB，JAK-STAT，MAPK等多条信号通路[6]，小檗红碱抑制核因子κB转运来发挥抗炎作用[7]，进而保护肠黏膜屏障，恢复机体正常免疫应答;槲皮素可抑制T、B细胞增殖和细胞因子的分泌，具有良好的抗炎活性[8];非洲防己碱具有抗菌、抗炎、抗组胺、强心、抗癌的药理作用;甲基黄连碱具有抗微生物、抗原虫的药理作用药物[9]。黄连-黄柏药对的潜在有效活动成分对应207个靶点基因，运用GeneCards平台及OMIM数据库收集UC相关靶点基因为224个，将药物及疾病靶点取交集后得到34个关键靶点基因，其中排名前十的关键靶点基因为PTGS2、IL6、CXCL8、VEGFA、TNF、MMMP9、AKT1、CCL2、IL10、TP53，预测这些靶点在黄连-黄柏药对治疗UC中有重大的作用。这些关键靶点在治疗UC中主要体现了以下的作用，如PTGS2/COX2（前列腺素内过氧化物酶/环氧化酶-2）在调节炎症反应方面起着至关重要的作用，已证实PTGS2在急性炎症的启动和解析过程中是动态调节的，并且是由巨噬细胞中的炎症介质刺激引起的[10]。白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）及肿瘤坏死因子（TNF）在急性期存在相关细胞因子表达的异常。TNF有抗感染、调节免疫、促进细胞增殖分化等功能，对机体具有一定保护作用，而高水平TNF是重要的炎症介质，介导炎症反应，引起局部炎症反应，IL-6参与细胞免疫、体液免疫的调节，在自身免疫、炎症反应等方面起重要作用。IL-10为一种抑制性淋巴因子，调节免疫细胞增殖分化、限制炎症反应[11]。PTGS2/COX2、IL-6、IL-10以及TNF均是与炎症反应相关的基因，这也证实“黄连-黄柏”在治疗溃疡性结肠炎通过调控炎症基因达到治疗目的。CXCL8是炎症趋化因子，目前已知是肿瘤增殖、血管生成和侵袭的诱导物[12]。VEGFA是血管内皮生长因子A，具有调节血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[13]。MMMP9是基质金属蛋白酶（MMPs）家族中一员，是肿瘤细胞生存过程中的主要调控因子[14]，AKT1是AKT家族一员，可抑制凋亡和促進细胞生长，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡[15]。CCL2参与炎症反应、血管新生、损伤修复的过程，其参与肿瘤发生和进展，可直接作用于肿瘤细胞参与肿瘤血管形成[16]。CXCL8、VEGFA、MMMP9、AKT1以及CCL2均是与肿瘤增殖或血管形成相关基因，这也证实该基因与溃疡性结肠炎具有癌变风险正相关。TP53基因现证实可作为恶性肿瘤早期诊断的分子标记，对早期筛查具有重要意义[17]。

GO富集分析显示关键靶点通过对机体的炎症反应，细胞对脂多糖的反应，蛋白磷酸化的正调控，一氧化氮生物合成过程，凋亡过程的负调控，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，趋化因子的正调控，生物合成过程中基因表达的正调控，转录的正调控，DNA模板正调控，序列特异性DNA结合转录因子活性正调控，核因子κB活性正调控，脂多糖介导的信号通路，蛋白激酶B信号，负调控细胞增殖等在细胞中发挥作用。

通过KEGG通路分析显示预测黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎在肿瘤坏死因子（TNF）信号通路，细胞因子-细胞因子受体的相互作用，低氧诱导因子-1信号通路，T细胞受体信号通路，产生IgA的肠道免疫网络，核因子κB信号通路，NOD样受体信号通路，Toll样受体信号通路等过程中发挥作用。其中细胞因子-细胞因子受体相互作用基因涉及的信号通路主要体现在趋化因子家族、TNF家族、IL-10家族等，目前证实细胞因子通过影响机体基因表达、细胞膜通透性、生物酶活性及细胞骨架蛋白功能等介导细胞的多种生理病理过程[18]。NOD样受体信号通路是免疫细胞识别病原体，发挥固有免疫效应的主要信号通路，与其通路相关基因有NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β，马克龙等[19]在研究中发现三黄汤可下调NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达水平，减轻肠道的炎症反应。Toll样受体信号通路失调可导致慢性炎症及肿瘤的发生及发展，Toll样信号通路异常激活可导致核因子κB信号通路的激活和TNF、IL-6等炎症介质的过度表达，还可以通过MMPs增加肿瘤细胞的侵袭[20]。以上这些通路都是黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的重要分子通路。

综上所述，使用网络药理学对黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的关键靶点基因及信号通路的分析预测，可进一步揭示黄连-黄柏药对可能通过细胞因子-细胞因子受体的相互作用，T细胞受体信号通路，核因子κB信号通路，NOD样受体信号通路，Toll样受体信号通路等介导炎症反应，调节趋化因子的正调控，生物合成过程中基因表达的正调控，NF-kappaB活性正调控，脂多糖介导的信号通路，负调控细胞增殖等，从而发挥其治疗溃疡性结肠炎的作用机制提供理论基础。然而，中药治疗溃疡性结肠炎的机制复杂，为能更进一步确切了解黄连-黄柏药对治疗溃疡性结肠炎的分子作用机制和病理生理过程，仍需要进行相关的实验研究加以佐证。

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（2021-09-01收稿 本文编辑：魏庆双）