增龄对大鼠心成纤维细胞生长和功能的影响*

王 琰 许亚平 王 前 罗欢欢 赵育洁 牛思泉 胥 良 郭志坤，4△

（郑州市第七人民医院，1 心内科，2 郑州市心脏结构研究重点实验室，郑州 450006；3 新乡学院护理学院，新乡 453003；4 新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室，新乡 453003）

心成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）约占心细胞的70%，对维持心正常结构和功能起重要作用。CFs 增殖能力强，即使在缺氧环境中，仍保持较高的增殖代谢能力[1]，此功能在心血管栓塞导致的心肌损伤修复中至关重要，可快速修复心损伤，防止心破裂和心力衰竭等。CFs 还分泌一些细胞因子，如内皮素[2]、白介素[3]、前列腺素[4]、促红细胞生成因子[5]等，参与组织的损伤修复和血管新生等。此外，成纤维细胞还具有多项分化潜能，可分化为肌腱细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞等[6-8]。这些研究结果提示，CFs 很可能在心肌修复过程中参与心肌再生。已有研究表明[9]，低等生物斑马鱼、蝾螈等发生心肌损伤时，可形成暂时性纤维瘢痕，而后心肌组织可完全再生，替代瘢痕组织；而心肌损伤发生在成年哺乳动物时，损伤部位则形成永久性纤维疤痕，严重影响心功能和预后[10-11]。因此心肌梗死后如何诱导激发包括CFs 在内的多种心肌再生因素是当前研究的热点之一。本课题组前期研究显示新生大鼠CFs 可表达多种干细胞表面标志物[12]，具有一定的干细胞功能特性，随培养代次的增加活化成为肌成纤维细胞的数量增加[13]。本研究通过分析不同时间段CFs 生长和功能的变化，探讨增龄对CFs 的潜在影响，旨在为心肌修复的基础研究和临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 原代大鼠CFs 的获取、培养及传代

120 只健康SD 大鼠购自新乡医学院实验动物中心，雌雄不限。其中新生大鼠（60 只，新生组）以75%乙醇消毒，1月龄（30 只，1月龄组）和3月龄（30 只，3月龄组）大鼠利用10%水合氯醛麻醉后备皮，75%的乙醇消毒后，置于无菌解剖板上，于胸骨剑突下稍左侧，迅速打开胸腔，切取心尖部组织，置于预冷的 DMEM 中，漂洗3 次，去除血液。在5 mL 玻璃瓶中加入2 mL 预冷的 HBSS，将心尖组织转入5 mL 玻璃瓶，用眼科剪将其剪成约1 mm3的小块，弃上清液，加入消化酶溶液（0.07%胰蛋白酶和0.05%Ⅱ型胶原酶溶液），置于培养箱8 min，每隔4 min 轻轻晃动玻璃瓶，8 min 后收集上清液。再次加入1.5 mL 消化酶溶液，置于培养箱8 min，每隔4 min 轻轻晃动玻璃瓶，重复以上步骤，共消化11～13 次至心肌组织块松软。加入5 mL 含10% FBS 的DMEM 培养基，轻轻吹打残余组织块，直至组织块基本消失，收集上清液置于含10% FBS 的DMEM 培养基中。1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，沉淀中加入5 mL 培养基轻轻吹打重悬细胞，将重悬的细胞过200 目细胞筛，将细胞移入25 cm2的培养瓶进行差速贴壁2 次，每次45 min。贴壁的细胞主要是成纤维细胞，加入5 mL 含10% FBS 的 DMEM 培养基，置入37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养，24 h后首次换液，以后每2 d 换液1 次。待细胞汇合至80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶（Amrescao，美国）按1∶2 消化传代。

1.2 免疫荧光染色鉴定CFs

将各组第3 代CFs 消化重悬，以3 000～5 000个细胞/孔接种于96 孔板，待细胞汇合约80%，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.3% Triton X-100 破膜10 min，10%山羊血清封闭40 min，加入兔来源一抗盘状结构域受体2（discoindin domain receptor 2，DDR2）（1∶50，Santa），每孔70 μL，4 ℃孵育过夜，加入Cy3 山羊抗兔二抗，室温避光孵育1 h，按每孔50 μL 加入10 μg/mL DAPI 染核，室温避光孵育15 min，荧光显微镜下观察拍照。

1.3 MTT 法检测细胞增殖

将各组第3 代 CFs 消化重悬，以3 000～5 000个细胞/孔接种于 96 孔板，24 h 贴壁稳定后开始检测。自贴壁24 h～贴壁第6 天，每天取1 板96 孔板，于各孔内加入5 g/L 的 MTT（Sigma，美国）10 μL和含10%胎牛血清的 DMEM（Hyclone，美国）90 μL，37 ℃孵育4 h，加入150 μL 的 DMSO，摇床上缓慢避光振荡10 min。用酶标仪测量各孔490 nm 波长处的吸光度值（OD 值）。取均值分析。

1.4 免疫荧光染色检测 CFs 的表面标志物

将各组第3代 CFs 消化重悬，以5 000～10 000个细胞/孔接种至96孔板，待细胞汇合达70%左右时，给予免疫荧光染色检测。4%多聚甲醛避光固定30 min，0.3% Triton X-100 破膜10 min，10%山羊血清封闭40 min，分别加入兔来源一 抗nanog（1 ∶500，Abcam）、sox2（1 ∶500，Abcam）、oct4（1∶500，Abcam）、scal-1（1∶500，Abcam）、c-kit（1∶500，Abcam），以每孔70 μL加入96 孔板，阴性对照为PBS 代替一抗，4 ℃过夜孵育，加入 Cy3 抗兔二抗，室温避光孵育1 h，每次3 min，以每孔50 μL 加入10 μg/mL DAPI 染核，室温避光孵育15 min，荧光显微镜下观察拍照。每个蛋白标志物的免疫荧光结果取6 个复孔，随机选取5～7 个视野，利用 Image J 6.0 软件测量平均光密度值，即光密度总和与面积比值，进行半定量分析。

1.5 免疫细胞化学显色检测 CFs 的表面标志物

将各组第3代 CFs 消化重悬，以5 000～10 000个细胞/孔接种至96孔板，待细胞汇合达70%左右时，给予免疫细胞化学检测。4%多聚甲醛避光固定30 min，A试剂（3% H2O2）室温作用细胞8 min，滴加B试剂（血清封闭液）室温作用20 min，分别加入兔来源一抗nanog（1∶500，Abcam）、sox2（1∶500，Abcam）、oct4（1∶500，Abcam）、scal-1（1∶500，Abcam）、c-kit（1∶500，Abcam），阴性对照为PBS代替一抗，4 ℃孵育过夜，加入C试剂（生物素标记山羊抗兔），室温避光20 min，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。倒置显微镜下观察拍照。

1.6 成脂、成骨和成心肌诱导分化

将各组第3代 CFs 消化重悬，以5 000～10 000个细胞/孔接种至96孔板，待细胞汇合达70%左右时，分别加入成脂、成骨、成心肌诱导液。成脂、成骨诱导液每2～3 d更换1次；成心肌诱导液24 h后更换完全培养基，之后每2～3 d更换完全培养基。成脂诱导7～9 d，4%多聚甲醛固定细胞，利用油红O染色试剂盒（Solarbio，北京）染色，显微镜下观察拍照；成骨诱导21 d，4%多聚甲醛固定细胞，利用茜素红染色试剂盒（Solarbio，北京）染色，显微镜下观察拍照；成心肌诱导21 d，利用免疫荧光染色 cTnT，荧光显微镜下观察拍照。

1.7 统计学处理

利用 SPSS 20.0 软件进行数据分析，计量资料以±s表示，两样本间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠 CFs 的形态特征

分离培养的大鼠CFs 贴壁生长，细胞呈长梭形、圆形或多角形，新生组细胞多呈圆形、长梭形，1月龄组和3月龄组细胞多呈多角形。原代、第1 代CFs 生长较快，第2 代、第3 代CFs 生长速度较前减慢。

2.2 不同时间段大鼠CFs DDR2 表达

免疫荧光染色显示，3 组大鼠CFs 均表达DDR2，符合心成纤维细胞特性（图1，见封二）。

图1 3 组大鼠CFs DDR2 表达，免疫荧光显色，倒置荧光显微镜，蓝色代表细胞核，红色代表Cy3 标记的DDR2.

2.3 大鼠 CFs 生长曲线比较

3 组大鼠CFs 总的生长趋势一直处于平稳上升，但上升幅度不同。培养24 h 贴壁稳定后至贴壁48 h，3 组CFs 生长速度无明显差异；2～3 d新生组CFs 生长速度与1月龄组和3月龄组差异无统计学意义（P＞0.05）；3～4 d 3 组CFs 的生长速度差异达高峰，新生组高于1月龄组和3月龄组，差异有统计学意义（P＜0.05），但1月龄组和3月龄组生长速度差异无统计学意义；4～5 d 3 组CFs 的OD 值较前无明显变化，1月龄组的生长速度高于3月龄组，而新生组仍高于1月龄组和3月龄组；5～6 d 新生组 CFs 的曲线变化不大。提示不同年龄CFs 在4 d 均进入生长平台期，但各年龄段仍存在增殖差异（图2）。

图2 3 组大鼠CFs 的细胞生长曲线

2.4 大鼠 CFs 5 种表面标志物表达

免疫荧光染色结果显示，3 组大鼠第3 代CFs均表达 nanog、sox2、oct4、scal-1、c-kit 表面标志物（图3～5，见封二），但存在年龄差异。新生组CFs 的表面标志物表达水平均高于1月龄组和3月龄组（P＜0.05，P＜0.01），1月龄组多种表面标志物的表达水平均高于3月龄组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图4）。

图3 3 组大鼠CFs 的5 种干细胞表面标志物（nanog、sox2、oct4、scal-1、c-kit）表达，免疫荧光显色（蓝色代表细胞核，红色代表Cy3 标记的nanog、sox2、oct4、scal-1、c-kit），标尺=200 μm。A：新生组；B：1月龄组；C：3月龄组.

图4 3 组大鼠CFs 的表面标志物表达比较

免疫细胞化学显色结果显示，3 组大鼠CFs 均表达 nanog、sox2、oct4、sca-1、c-kit 表面标志物，表达部位位于细胞质内（图5，封二）。

图5 3 组大鼠第3 代CFs 5 种干细胞表面标志物表达，免疫组织化学显色，标尺=200 μm。A：新生组；B：1月龄组；C：3月龄组.

2.5 大鼠 CFs 的多向分化比较

3 组大鼠 CFs 成脂诱导后，均有红色脂滴生成，表明CFs 有成脂分化能力（图6，见封二）；成骨诱导后，茜素红染色显示有红色钙结节沉着形成，说明CFs 有成骨分化能力（图6，见封二）；成心肌诱导后，免疫荧光染色显示cTnT 表达阳性，提示CFs有成心肌分化能力（图7，见封二）。

图6 3 组大鼠CFs 的成脂（A1、B1、C1）及成骨（A2、B2、C2）诱导。油红和茜素红染色（红色代表脂滴，蓝色代表细胞核）。标尺=100 μm。A：新生组；B：1月龄组；C：3月龄组.

图7 3 组大鼠CFs 成心肌诱导，免疫荧光显色（蓝色示细胞核，红色代表 cTnT 阳性表达）。标尺=200 μm。A：新生组；B：1月龄组；C：3月龄组.

3 讨论

CFs 作为心肌损伤修复中的主要参与细胞，其体外培养可表达干细胞的表面标志物，并可诱导为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞等[6-7]，表明CFs 具有高度的幼稚性和多向分化潜能，这为进一步研究CFs 参与心肌再生提供了实验依据。此外CFs 可通过分泌一些细胞因子，如内皮素[2]、白介素[3]、前列腺素[4]、促红细胞生成因子[5]等，参与组织损伤修复和血管新生等。研究显示[14]，利用MyoD 修饰成纤维细胞可将其转化为骨骼肌，而将Gata4、Mef2c 和Tbx5 基因修饰CFs 可使其转化为心肌样细胞[15]。这些研究结果为CFs 转分化为心肌细胞奠定了实验基础。CFs 作为心肌损伤修复的主要细胞之一，其功能特性是否随增龄增加而发生改变？目前研究较少。本研究对CFs 的生长速度、多种表面干细胞标志物的表达，以及成脂、成骨、成心肌的多向分化能力检测显示，CFs 的生长速度、多种表面标志物表达和多向分化能力随增龄变化而逐渐下降，其中形态变化和生长速度变化明显。此变化是否反映了CFs 随年龄的增长逐渐发生“老化”，以及参与心肌修复和再生的能力是否逐渐降低？了解这一点对全面判断CFs 的生物学特性，阻止CFs 的老化进程，更好地利用和发挥其心肌再生能力都十分关键。

本课题组最近的研究显示，新生大鼠CFs可表达nanog、sox2、c-kit、scal-1、Tbx5、CD73、CD34、cMyc、klf4、Gata4、oct4、Mef2c 等表面标志物[16]，本研究结果再次证明CFs 在不同年龄段均表达nanog、sox2、oct4、scal-1 和c-kit，而以上这些标志物大多都是干细胞标志物。一般认为，能够同时表达3 种以上的干细胞标志物可视为干细胞，因此，笔者认为CFs 具有干细胞特征和高度的幼稚性，是组织分化修复良好的种子储备细胞。本研究和以往研究的不同在于证明了CFs 存在明显的年龄差异。本研究结果显示nanog 分子表达，新生组＞3月龄组＞1月龄组，随增龄变化先表达下降，后稍上升，但低于新生组；sox2、oct4 的表达，新生组＞1月龄组＞3月龄组，随增龄变化而下降。这3 个分子对于维持胚胎干细胞亚全能性起关键作用，整体表达随年龄增长而下降，可能与成纤维细胞“干性”减弱有关。而scal-1 的表达，1月龄组＞新生组＞3月龄组；c-kit 的表达，1月龄组和3月龄组＞新生组，但1月龄组和3月龄组表达无差异。由此可见，除scal-1、c-kit 外，新生组其余表面标志物的表达均高于1月龄组和3月龄组，随增龄变化而下降，而scal-1 的表达随增龄变化先升高后下降，c-kit 的表达随增龄变化而升高，在成年后表达趋于稳定。这2 个分子既往被作为心干细胞的表面分子标志物，在成纤维细胞中的表达特点可能与细胞老化导致自身调节“干性”表达升高有关。因此，年龄对细胞表面标志物的表达虽有影响，但并不稳定，无明显的规律性变化。本研究对CFs 成脂、成骨、成心肌诱导结果证实，虽然各组细胞均有多向分化潜能，但成脂能力随年龄增长而下降，成心肌能力随年龄增长先增强，而后有所下降。对各组间分化差异比较显示3月龄组分化潜能与新生组和1月龄组差异无统计学意义。综上提示增龄可影响CFs 的形态变化、生长速度和多种表面标志物表达水平，但对其多向分化能力影响无明显差异，说明CFs 在年龄变化过程中一直保持着较为旺盛的分化能力，这为更好地研究和利用CFs 提供了新的思路。