lncRNA MVIH在结直肠癌细胞中表达及干扰其表达对SW620细胞功能的影响

张森 王建锋 厉冰

(南阳市中心医院胃肠外科，河南 南阳 473009)

结直肠癌是全球常见的第三大恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因；近年来其发病率在我国有明显升高的趋势，严重威胁着人们的身体健康和生活质量〔1，2〕。目前，复发、转移和耐药等是制约结直肠癌治疗效果的重要原因〔3〕。因此，深入研究结直肠癌发生发展的分子机制，寻找确定有效抑制结直肠癌恶性增殖和转移的治疗靶点是十分必要的。长链非编码RNA是一类不具有编码蛋白质功能的长链RNA，被证实其异常表达可通过不同方式影响细胞增殖、转移和分化等，与结直肠癌发生发展密切相关〔4～6〕。研究〔7～9〕显示，肝癌微血管浸润相关的lncRNA(lncRNA MVIH)在胃癌、乳腺癌和肝癌等肿瘤中异常高表达，与患者预后不良密切相关，且可通过影响增殖、转移和侵袭等细胞生物学功能发挥致癌作用。有学者〔10〕指出，lncRNA MVIH在结直肠癌组织中表达上调，且其高表达水平与患者转移、生存期短有关；然而lncRNA MVIH在结直肠癌细胞中表达及作用未见报道。故本研究设计体外细胞实验观察lncRNA MVIH在结直肠癌细胞中的表达及干扰其表达对癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 人正常结直肠上皮细胞株FHC(广州吉妮欧生物科技公司)；人结直肠癌细胞株SW480、HT29、LOVO和SW620(中科院上海细胞库)；RPMI1640培养基和0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；胎牛血清和青链霉素混合液(美国Gibco公司)；增强化学发光液(ECL)、CCK-8试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒(上海碧云天公司)；实时定量-聚合酶链反应(PCR)试剂盒、RNA逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司);转染试剂脂质体2000和Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技公司)；兔抗人E-钙黏附蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-cadherin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥公司)。

1.2细胞培养 向解冻复苏后的FHC、SW480、HT29、LOVO和SW620细胞中加入含10%胎牛血清和100 U/ml青链霉素混合液的RPMI1640培养基，置于饱和湿度、5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中常规培养。待细胞贴壁80%左右时，加入0.25%胰蛋白酶消化，并以1∶2比例传代。选取长势良好的第3代对数生长期细胞进行实验。

1.3实时荧光定量PCR检测 采用Trizol法提取FHC、SW480、HT29、LOVO和SW620细胞的总RNA后，参照RNA逆转录试剂盒说明书进行逆转录，以逆转录产物为模板，GAPDH为内参，根据实时定量PCR试剂盒说明书步骤，采用2-△△Ct法检测细胞中lncRNA MVIH的表达水平。其中，由上海生工生物合成的PCR引物如下：LncRNA MVIH上游引物序列为5′-AATTTTGCACATCTGAACAGCC-3′，下游引物序列为5′-TTCAAAATCCCA-CTACGCCCA-3′；GAPDH上游引物序列为5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物序列为5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。实验重复3次。

1.4细胞分组和转染 实验分为:①对照组：正常培养；②阴性组：转染lncRNA MVIH干扰序列的阴性对照si-NC；③干扰组：转染lncRNA MVIH干扰序列si-MVIH，每组设置3个重复。将对数生长期的SW620以每孔3×104个接种至6孔细胞板上后，在饱和湿度、5%CO2、37℃条件下常规培养过夜。待细胞达75%汇合度时，参照转染试剂脂质体2000说明书，根据实验分组将si-NC和si-MVIH分别转染至SW620细胞中。转染5 h后更换新鲜培养液继续培养。待培养48 h后，胰蛋白酶消化收集各组细胞，并采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中lncRNA MVIH的表达水平以评价转染效果。

1.5CCK-8法检测细胞增殖 将转染48 h后的3组细胞以每孔100 μl(含103个细胞)接种至96孔细胞板上，另将不含细胞的培养基作为调零孔。在细胞培养箱中常规培养，分别在培养24、48、72和96 h时取样，参照CCK-8试剂盒说明书检测各组细胞在450 nm处的光密度(OD)值。重复检测3次。

1.6平板克隆实验 将对数生长期的3组细胞以每孔100 μl(含103个细胞)接种至6孔细胞板上，置于细胞培养箱内常规培养12～15 d，当肉眼可见克隆时终止培养。以甲醛固定细胞20 min后，使用0.1%结晶紫染色15 min。洗去染液后，自然晾干。将超过50个细胞的集落作为1个有效克隆数，在倒置显微镜下拍照并统计各组克隆细胞数。实验重复3次。

1.7Transwell小室检测 采用无血清培养基将对数生长期的3组细胞制成浓度为3×105个/ml单细胞悬液。取细胞悬液200 μl接种于人工基底膜包被(侵袭实验)或者未包被(迁移实验)的Transwell小室上室中，并在下室中加入600 μl含血清的培养基。置于细胞培养箱内常规培养过夜后，将小室取出，使用棉签小心擦去上室内残留的细胞，以4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染色。洗去染液后，自然干燥，在倒置显微镜下每个样品随机选取3个视野观察各组的穿膜细胞数。

1.8Western印迹 测参照全蛋白提取试剂盒说明书步骤，提取转染48 h后的3组细胞的总蛋白，并采用BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书定量总蛋白的浓度。将蛋白样品与等体积上样缓冲液混匀后，在沸水浴中煮沸变性5 min。按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书制备SDS-PAGE凝胶，按照每孔60 μg样品上样行电泳分离。电泳结束后，转至聚偏氟乙烯膜。经5%脱脂奶粉封膜2 h后，浸入E-cadherin(1∶800)、Vimentin(1∶800)、N-cadherin(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗工作液4℃下孵育24 h。次日，再以辣根过氧化物酶标记二抗(1∶200)室温孵育1.5 h后，滴加ECL显色剂暗室内显影曝光。以GAPDH为内参，采用凝胶成像系统扫描分析各组细胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表达水平。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、t检验。

2 结 果

2.1lncRNA MVIH在不同结直肠癌细胞系中的表达 FHC、SW480、HT29、LOVO、SW620细胞lncRNA MVIH的相对表达量分别为1.00±0.00、1.72±0.13、1.58±0.10、1.85±0.16和2.38±0.21，5种细胞株lncRNA MVIH表达水平差异显著(F=76.826，P=0.000)。与FHC细胞相比，SW480、HT29、LOVO和SW620细胞lncRNA MVIH表达水平均显著升高(P<0.05)，且SW620细胞lncRNA MVIH表达水平最高(P<0.05)。故选用SW620细胞进行实验。

2.2转染后结直肠癌SW620细胞lncRNA MVIH的表达 与对照组相比，阴性组lncRNA MVIH表达水平无显著差异(P>0.05)，干扰组lncRNA MVIH表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3下调lncRNA MVIH对结直肠癌SW620细胞增殖 与对照组相比，阴性组24 h后增殖能力、克隆细胞数无显著差异(P>0.05)，干扰组48 h后增殖能力、克隆细胞数均显著降低(P<0.05)。见表1、图1。

图1 下调lncRNA MVIH对结直肠癌SW620细胞克隆增殖能力的影响

2.4下调lncRNA MVIH对结直肠癌SW620细胞侵袭迁移的影响 与对照组相比，阴性组侵袭和迁移细胞数无显著差异(P>0.05)，干扰组侵袭和迁移细胞数显著减少(P<0.05)。见图2、表2。

图2 下调lncRNA MVIH对结直肠癌SW620细胞侵袭、迁移的影响(结晶紫，×200)

表2 各组侵袭、迁移细胞数比较个)

2.5下调lncRNA MVIH对结直肠癌SW620细胞上皮间质转化的影响 与对照组相比，阴性组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白无显著差异(P>0.05)，干扰组E-cadherin蛋白显著升高，而N-cadherin和Vimentin蛋白显著降低(P<0.05)。见图3和表3。

图3 Western印迹检测Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达

表3 各组Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平比较

3 讨 论

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国每年结直肠癌的新发病例和死亡病例约有25万和14万〔11〕。由于结直肠癌早期症状隐匿，多数患者就诊时已为晚期，发生局部转移，错失手术治疗的最佳时期，而针对晚期常用的化疗会引起一定的副作用，且癌细胞产生的耐药使患者5年生存率不高〔12〕。异常表达的lncRNA如lncRNA-MALAT1、ZFAS1等在结直肠癌中发挥着抑癌或致癌的重要作用，被认为是结直肠癌潜在的治疗靶点〔13～15〕。研究显示，lncRNA MVIH与肿瘤的发生发展密切相关〔16〕。Nie等〔17〕指出，lncRNA MVIH在非小细胞肺癌组织中表达升高，且其表达水平与患者预后、肿瘤的TNM分期、肿瘤大小及淋巴结转移等密切相关；敲低lncRNA MVIH表达可通过调控基质金属蛋白酶(MMP)-2/9抑制癌细胞增殖和侵袭。Zhuang等〔18〕报道，在胶质瘤细胞系和组织中lncRNA MVIH表达上调，lncRNA MVIH表达的改变与患者总生存率低有关；体外细胞实验得出lncRNA MVIH表达上调可促进胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移，反之，下调lncRNA MVIH表达则抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移；lncRNA MVIH被认为是一种胶质瘤潜在的治疗靶点。尽管唐曦等〔10〕指出lncRNA MVIH高表达与结直肠癌患者预后不良、生存时间短和淋巴结转移有关，但lncRNA MVIH在结直肠癌中的作用并不清楚。本研究结果提示lncRNA MVIH可能在结直肠癌细胞中发挥着重要作用；下调lncRNA MVIH表达可抑制SW620细胞增殖、侵袭和迁移。上皮间质转化是一种上皮细胞转化为具有间质表型的生物过程，可赋予细胞转移和入侵的能力，是肿瘤转移的关键；上皮标志物E-cadherin表达减少及间质标志物Vimentin等表达增多是上皮间质转化的主要特征〔19，20〕。耿宣等〔21〕研究指出，E-cadherin在结直肠癌组织中表达减少，N-cadherin和Vimentin表达增多，与肿瘤淋巴转移、肝转移等密切相关，被认为与结直肠癌发生发展密切相关。本研究结果提示lncRNA MVIH可通过调控细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化参与结直肠癌发生发展。