微量元素锌对视网膜衰老及炎症影响的研究进展

汪水风 邵毅

(南昌大学第一附属医院眼科，江西 南昌 330006)

锌是所有生物所必需的微量营养素，为人体内第二丰富的微量元素〔1〕。人体内只有约0.1%的锌含量在血浆中。约60%的锌含量存在于骨骼肌中，30%存在于骨中。锌在小肠中被吸收，通过皮肤、汗液、肾脏、尿液、大肠或结肠和粪便中排出〔2〕。锌是唯一缺乏生物氧化还原活性的过渡金属离子，它充当质子供体，使锌成为理想的酶促因子〔3，4〕。锌既可直接参与化学催化，也可通过维持蛋白质结构或稳定性间接参与〔5〕。因此，它在多种生物过程中起着重要的调节作用，作为300多种酶的催化剂和包含在数千种蛋白质中的锌指结构域〔6，7〕。锌在DNA合成、RNA转录、细胞分裂和活化及在防止细胞凋亡等基本过程中发挥着关键作用〔8〕。它在影响细胞功能的信号转导方面也发挥着重要作用，尤其是对免疫系统的发育和完整性的影响，其影响先天性和适应性免疫应答〔7〕。眼部较其他器官和组织，锌含量异常高，锌含量最高的是视网膜色素上皮细胞(RPE)，其次是视网膜〔9，10〕。锌在眼内其他各组织的含量从多到少的顺序为(降序)：睫状体、虹膜、视神经、巩膜、角膜、晶状体〔11〕。本文就锌对视网膜衰老及炎症影响的研究进展进行综述。

1 正常视网膜中的锌

神经视网膜通过视神经与大脑连接，其血供来源于视网膜中央动脉。小分子(蛋白质和脂质)在视网膜血管的运输由内皮细胞之间的紧密连接控制，内皮细胞之间的紧密连接构成内部血-视网膜屏障。视杆细胞、视锥细胞和光感受器内段之间的黏附连接称为外边缘膜的屏障，将视网膜区域与视网膜下空间隔开。在视网膜下是单层的RPE，它的主要功能是支持视网膜，通过其高色素含量减少光的反向散射，并消除视觉周期产生的代谢物，还可阻止新血管从下面的脉络膜血管系统生长到视网膜层。RPE和Bruch膜一起形成外部血-视网膜屏障，可防止大分子和免疫细胞从下面的脉络膜进入光感受器层。位于Bruch膜下方的脉络膜含有密集的血管网络(脉络膜毛细血管)，为RPE、视网膜和视神经提供氧气和营养。相比之下，Müller细胞(一种特殊形式的局部视网膜胶质细胞)则遍布整个视网膜。作为正常老化过程的一部分，代谢物在视网膜-RPE和RPE-脉络膜界面中积累。它的提前老化可能导致疾病，如年龄相关性黄斑变性(AMD)。

1.1锌在视网膜脉络膜复合体中的分布 视网膜-脉络膜复合体中含有高浓度的锌，总细胞锌浓度约为100 μmol/L〔12〕。大多数细胞内锌与蛋白质紧密结合，具有高结合亲和力，可增加细胞内锌的利用〔13，14〕。在视网膜组织中，锌通常储存在神经节细胞、水平细胞和无长突细胞内。研究证明〔13〕在视网膜Müller细胞内也含有锌。视网膜神经元的去极化可诱导丛状层的锌释放，这为视网膜中锌的神经调节剂作用提供了第一个证据〔15〕。从感光体的突触末端，并通过负反馈谷氨酸内源锌共同释放时，减少钙和谷氨酸的结合，伴随囊泡将谷氨酸释放到细胞外。因此，这可能保护视网膜免受谷氨酸兴奋毒性〔16〕。

1.2锌在视网膜脉络膜复合体中发病机制 除了存在于细胞器中之外，细胞内锌存在于光感受器的外段〔14〕，其中锌的作用主要依赖于光的暗适应。事实上，锌可能通过稳定视紫红质来稳定外段的膜。然而，额外低亲和力锌与特定组氨酸位点的结合也会导致视紫红质的去稳定化〔16〕，并降低热稳定性，表明视紫红质可能在光照下比在黑暗中更不稳定，这种锌诱导的视紫红质去稳定化可能与遗传性视网膜疾病相关。值得注意的是，视网膜色素变性与系统性锌缺乏有关。维生素A对维持视网膜暗适应功能极其重要，光感受器外段中的锌含量也可影响锌依赖性醇脱氢酶的活性，从而影响视网膜中维生素A的转化〔17〕。通过影响肝脏中维生素A结合蛋白的合成或释放，锌也可能参与暗适应。锌是维生素A代谢的重要金属离子。锌通过参加视黄醛结合蛋白的生物合成和维生素A醇向维生素A醛的转化，以调控维生素A的代谢，维持视网膜视杆细胞的功能。视黄醛、维生素A相互转化的过程中，需要乙醇脱氢酶和视黄醛还原酶的参与，而锌正是这两种酶的重要金属离子。

事实上，疾病时锌元素分布中RPE层中的锌首先减少〔9〕。RPE色素沉着作为黑色素合成和黑素体的形成似乎是由锌来调节〔9〕。黄斑区的锌含量可能比周围性视网膜色素上皮少，并认为黄斑区锌水平可能进一步受老化的影响。Bruch膜含有大量的锌，特别是在患有AMD的眼中。眼部脉络膜锌浓度含量最高〔10〕。由于脉络膜是高度着色层，所以可能是色素锌促成了这种富集。结合锌和脉络膜色素的证据提示了锌、脉络膜色素和脉络膜视网膜炎症之间的可能存在关系，由于AMD的RPE功能障碍，锌的积累和源自脉络膜色素的抗原的暴露可能导致视网膜炎症。然而，目前人们对锌在脉络膜中的作用和功能及其与炎症的关系知之甚少，除了锌随着年龄的增长而积累外〔10〕，其也可促进老化眼睛内层中的锌缺乏的发展〔18〕。 根据了解到的锌、炎症和免疫之间的关系，考虑可能与视网膜炎症有关。

2 锌对衰老视网膜的影响

生物体内的氧自由基水平位随年龄增长而不断积累，造成机体组织的老化，体内依赖消除氧自由基的酶如超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)等和维生素A、E、C等抗自由基物质来调节自由基代谢的平衡，微量元素锌是某些酶的主要构成成分，可以稳定脂蛋白的结构与性质，并具有发挥酶的催化功能。

2.1AMD 在发达国家，高达30%的老年人缺锌，并且已经认识到锌可能在衰老的退行性疾病中起重要作用，作为抗氧化途径的调节剂和抗炎剂〔19〕。视网膜老化，特别是视网膜中央黄斑区，被认为是影响视力的最重要的部位之一。尤其AMD影响了大约1/4的65岁以上的人〔20〕。AMD的特征性病变是脉络膜和RPE之间存在玻璃体疣。临床上，玻璃体疣用于监测视力丧失的进展，因为其他类型的沉积物不易观察。研究发现，小玻璃膜疣可能并不总是与视力丧失的风险相关。然而，位于黄斑区域的多个大玻璃疣会增加AMD的风险。除了蛋白质和脂质，玻璃疣含有锌的异常沉积，其中一些是可更换(离子或松散结合的蛋白质)的形式存在〔14〕。随着年龄增长，玻璃体疣的积累后又通过RPE扭曲和破裂并推入神经视网膜的能力。因此，亚RPE沉积物形成的发展和进展可能是AMD发病机制中的关键因素。

干性AMD可分为早期、中期和晚期。RPE细胞的体外研究证实，随着年龄的增加，内源性锌水平降低，并且RPE基底侧局部化的锌2和锌4随着年龄的增加而降低〔4〕。Newsome等〔18〕研究表明在有AMD症状的人眼中锌的水平降低。大鼠中光诱导的视网膜变性和视细胞损伤导致与炎症、细胞凋亡、细胞因子产生和先天免疫反应相关的基因表达变化，这些途径可通过补锌，结合年龄相关眼病研究(AREDS)抗氧化补充剂配方和其他抗氧化剂来抑制〔21，22〕。RPE中锌的变化可能在AMD的发展中起着多重作用。RPE的功能是富含锌的光感受器外部区段的吞噬作用和加工，潜在地进一步丰富RPE内锌含量。由于RPE损伤被认为是AMD发展和进展的前兆〔20〕，因此RPE的异常锌释放可能由于上述损害而发生。脉络膜也含有丰富的锌，与AMD相关的变化〔23〕也可能导致Bruch膜中锌的积累。表明Bruch膜中的缓冲锌在调节亚RPE沉积物形成和AMD的发展中可能起着重要的作用。

2.2锌和AMD的临床研究 一项针对日剂量硫酸锌(100 mg)与安慰剂相比的随机对照试验的单中心研究显示〔24〕，与基线相比，较安慰剂组视敏度变化具有显著的阳性治疗效果，最终视力下降的可能性降低。因此，那种认为通过饮食补充或恢复平衡的锌可防止AMD提供了一个有趣的和潜在的廉价的干预策略和后续的临床试验。在AREDS2中添加叶黄素类胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质，添加或不添加omega-3脂肪酸，表明这些成分可能有助于防止AMD进展和相关的视力丧失〔6〕。研究表明，补充锌与AREDS配方和其他抗氧化剂联合使用可抑制视网膜退行性通路〔22〕。与AREDS同时，一项基于人群的队列研究表明〔25〕，锌的摄入量高于维生素E、C和胡萝卜素的中位数，与降低35%AMD事件风险有关。另一项研究进一步证实了这一点〔26〕，较高的膳食锌摄入对AMD事件有良好的影响。

补锌的效果可根据遗传背景确定。有研究显示，锌营养对早期携带高补体因子H基因(CFH)遗传风险变异的AMD患者有益〔27〕。进行ARDS研究的患者仅携带与年龄相关的黄斑病变敏感性(ARMs)2风险等位基因，而不是CFH，从含锌ARDS配方中获得最大获益〔28〕。此外，锌补充试验和流行病学研究之间存在一些相互矛盾的结果。因此，需要进一步研究锌在AMD发病中的作用。

2.3AMD的锌和补体 由于该CFH多态性(在已知结合肝素和C-反应蛋白的区域)被发现与AMD密切相关，先天免疫的补体成分在AMD的发病机制中起重要作用。CFH与单核吞噬细胞的结合抑制了CD47介导的小鼠视网膜模型系统固有免疫细胞的消除〔29〕。因此，CFH突变体的存在可能抑制由巨噬细胞驱动的CD47介导的视网膜炎症的消退，并破坏视网膜下空间的稳态。CFH及其Tyr402突变体可能与锌、亚RPE沉积形成和AMD有关〔30〕。在高于20 μmol/L锌浓度水平下，CFH在试管中形成大的低聚体在200 μmol/L锌浓度水平下，超过85%的CFH是低聚体，并处于完全抑制状态，因此本文推测在AMD患者的Bruch膜也会发生类似的低聚化。研究已经表明，CFH的失活和旁路C3的不受控制的激活导致继发性C3缺乏，是导致AMD的病理过程的一部分。此外，Hageman等〔30〕研究表明，CFH与C3b/iC3b，膜攻击复合物和C5b-9是亚RPE沉积物的成分。因此，从RPE中释放异常高水平的锌会对其产生损伤，并且如上所述，Bruch膜在AMD中含有高浓度锌〔16〕。作为低聚CFH将具有减弱补体抑制剂的功能，RPE和脉络膜将面临替代通路介导的补体攻击的持续风险。在补体系统中，锌可能不仅仅影响CFH，可与许多补体蛋白结合并以几种不同的方式影响补体活性。以上这些数据似乎支持补体介导的炎症是AMD的主要病理驱动因素〔30〕。

3 锌对视网膜炎症的影响

3.1锌的抗炎机制 锌作为体液免疫和细胞免疫的调节剂，还可起到抗炎的作用。锌对免疫系统的先天和适应性的发育和维持至关重要，因此在炎症的调节中起关键作用。已知衰老会影响老年人的免疫功能，主要是以T细胞介导的免疫反应为特征的适应性免疫，这些变化被称为免疫衰老。免疫衰老可能导致免疫失调，从而导致促炎细胞因子的产生，这种状态被称为炎性衰老〔31〕。 关于细胞免疫，缺锌和补锌都对T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞和巨噬细胞的发育和功能具有重要作用。锌对T细胞的细胞因子信号传导和T细胞活化诱导的细胞死亡特别是与年龄相关的影响已被观察到，其可在体外通过锌进行调节〔31〕。

众所周知，几乎所有与年龄相关的退行性疾病都涉及慢性炎症，包括发生在免疫耐受组织中，如视网膜和大脑。眼睛免疫耐受失败可导致典型的自身免疫型炎症，表现为葡萄膜炎的炎性疾病。对老年人补锌的研究表明，补充这一人群的锌缺乏症可降低感染发生率和炎症细胞因子的产生〔19〕。已显示自身免疫性眼色素层炎中的炎症由Th1和Th17 T细胞亚群介导，并且可被调节T细胞(Treg)抑制〔32〕。胸腺来源和外周诱导的Treg是抑制自身反应性T细胞和其他内源性炎症来源的重要生理免疫机制。在实验自身免疫性脑炎(EAE)的小鼠模型，减少体内实验锌给药，降低的Th17细胞维A酸孤儿受体γT细胞和显著增加诱导型调节性T细胞〔33〕。因此，有学者提出补锌能通过增加Treg细胞活性诱导不需要的免疫反应中的耐受性，并且已经提出锌作为治疗自身免疫炎症的工具，而不抑制整个免疫系统〔33〕。

3.2锌在视网膜炎症中的作用 轻度缺锌在老年人中很常见，其特征是随着年龄的增长，血清或血浆锌水平下降〔34〕。使用体外细胞培养系统和老年小鼠模型确定锌缺乏和年龄对炎症反应诱导的影响的研究表明，锌缺乏，特别是免疫细胞中细胞内锌的减少，与年龄增加的炎症反应有关，研究表明通过膳食补充剂恢复锌的状态可减少老年人相关的炎症〔35〕。 在衰老的眼睛中，特别是在RPE的水平上，存在氧化应激产物的积累，如活性氧(ROS)，其进一步驱动氧化应激，并且可能改变RPE的代谢〔36〕。ROS是由光感受器外部区段的吞噬作用产生的视觉循环的副产物，或来源于眼内特有的光氧化应激的环境，可以促进视网膜中氧化应激引起的病理性炎症活动。

免疫细胞和组织支持的间质细胞，如视网膜和脉络膜中的RPE和小胶质细胞，都能够控制和抵抗免疫反应，并且有人认为在视网膜老化中这些细胞可能是炎症的关键介质〔36〕。巨噬细胞和树突细胞通常不存在于视网膜中，而是存在于下面的脉络膜中。免疫细胞从下面的脉络膜或从体循环进入视网膜进行调节〔37〕。因此，氧化损伤可能是AMD的一个初始诱因，而这种生理应激的增加可能会激活固有的免疫细胞，进一步导致细胞和组织损伤，从而导致功能的丧失。小胶质细胞可能在视网膜下空间积聚，有益于炎症损伤的症状和对损伤的反应，但在AMD中，亚RPE空间中细胞和代谢废物的积累加剧了与年龄相关的变性的进展〔36，37〕。巨噬细胞在AMD发病机制中也起着重要作用。巨噬细胞是在RPE萎缩、Bruch膜的破裂和脉络膜新血管形成的作用相似〔38〕。随着老化的视网膜细胞损伤和氧化应激的积累，巨噬细胞可能变得负担过重，而且其在衰老过程中逐渐丧失吞噬能力〔38〕。众所周知，锌的缺乏会对巨噬细胞功能产生不利影响，导致吞噬作用和细胞因子产生的失调，这些均支持了锌的局部有效性可能影响由驻留免疫细胞驱动的视网膜炎症水平。视网膜炎症可能具有类似的巨噬细胞对锌稳态和ROS产生的影响。

4 锌和微生物

锌可通过其对肠道中的微生物组和免疫细胞的影响间接影响视网膜炎症。人体免疫系统与居住在人体肠道的微生物具有高度共同进化的关系，从而维持宿主和常驻微生物之间的体内平衡〔39〕。锌与肠道细菌的关系，在胃肠免疫系统功能与整个生命健康和疾病中发挥重要作用〔39〕。“破坏宿主微生物体内平衡的微生物群结构和(或)功能的不平衡”，是许多非传染性炎性疾病的新兴特征。如果视网膜副炎症发展成慢性视网膜病变，并构成在正常体内平衡的移位，以适应AMD的新的生理或代谢条件下(如在许多其他慢性炎性疾病状态发生时)，在中断营养，微生物组和宿主代谢之间的相互关系可能是破坏正常体内平衡的关键因素。因此，该微生物群群落的组成决定了部分感染和易感性抗炎性疾病的水平。

肠道中的营养锌，通过与肠道微生物群的直接相互作用或通过肠黏膜中驻留T细胞的影响可能会导致全身性炎症，并因此刺激局部视网膜炎症的免疫细胞。锌对大多数生物(包括许多细菌)的生长至关重要，这些生物需要吸收锌才能生长。过量的饮食锌显著改变肠道微生物菌群，在梭状芽孢杆菌等致病菌的殖民环境中，通过增加毒素活性和改变宿主的免疫反应，可能会加重梭状芽孢杆菌相关疾病。这些发现表明〔40〕，微生物组的组成可作为一种潜在的工具，以预后和诊断炎症的身体部位远至肠道。

5 锌补充的潜在风险和未来方向

人体内没有专门的锌储存系统，所以需要每天摄入足够的锌，以达到适当的免疫功能的稳定状态。在英国，建议的每日锌摄入量(参考营养素摄入量)成年男性为9.5 mg，成年女性为7.0 mg〔21〕。英国食品标准局和英国卫生部建议，锌的摄入量不应超过每天25 mg，但通常人们服用的锌补充剂>80 mg/d。欧洲食品安全局(EFSA)2009年小组报告指出，锌的膳食摄入与以下生物功能建立了因果关系：免疫系统的正常功能；正常的DNA合成和细胞分裂；保护DNA，蛋白质和脂质免受氧化损伤；维持正常骨骼；正常的认知功能；正常的生育和繁殖；脂肪酸的正常代谢；正常的酸碱代谢；正常的维生素A代谢和维持正常视力〔3〕。

5.1锌缺乏的临床表现 由于营养不良，经常发生锌缺乏症，特别是在老年人中。1961年首次从伊朗报道了一种怀疑为锌缺乏症继发的临床综合征，包括生长迟缓、男性性腺功能减退、皮肤变化、精神萎靡、肝脾肿大、铁缺乏性贫血和食土癖〔41〕。关于锌缺乏对视觉功能的影响，通过观察到补锌改善了酒精性肝病(肝硬化)患者的异常视觉暗适应，其机理可能是锌对肝脏中维生素A结合蛋白的合成或释放的影响。在一系列镰状细胞贫血患者和健康的人类受试者中也进行了类似的锌和暗适应的临床观察，表明这些对视觉功能的影响可能与饮食中锌缺乏有关。越来越多的研究表明〔22〕，饮食会影响局部视网膜锌的稳态。锌的补充可导致细胞内视网膜锌的含量更高，而锌缺乏的饮食诱导视网膜基因表达变化。光诱导的大鼠视网膜变性和视细胞损失导致基因水平的变化(归因于炎症、细胞凋亡、细胞因子、先天免疫反应及相关的受体)，并且这种类型诱导的视网膜退化性变化在氧化锌抗氧化剂的处理下呈现减少趋势。如前所述，视紫红质的锌诱导去稳定化可能是遗传性基因视网膜疾病，如视网膜色素变性，其也与全身缺锌相关联。

5.2锌过量的风险 生理条件下，童年和怀孕期间对锌的需求增加。锌吸收抑制剂是导致缺锌的最常见原因〔5〕，植酸盐存在于以碳水化合物为主要成分的食品中，对复合膳食上锌的吸收有强烈的抑制作用。因此，在任何群体中，从严重的病例到微量缺乏症和次优状态〔5〕，缺锌被认为发生在一个范围内，并且可能是饮食摄入和吸收的继发性疾病。高剂量的锌膳食补充已被证明会干扰膳食铜和铁的吸收。此外，虽然锌是炎症和免疫功能的重要调节因子，但其也可以抑制免疫系统，增加某些癌症的风险，包括转移性前列腺癌〔1〕。营养锌补充，存在潜在的安全风险，除了对疗效的问题，在AMD的背景下，导致了新公共卫生的利益和研究，主要集中在健康均衡的饮食成分和饮食模式，需要提供必要的维生素和微量营养素，以获得最佳的视觉和身体功能〔25〕。除了通过膳食补充锌来增加锌摄入量之外，通过改善可利用膳食锌的吸收来优化膳食锌摄入，例如通过最大程度降低肌醇六磷酸对锌吸收的影响。

综上，为了使锌营养科学的临床转化能够取得进展，需要开发有效、可靠和可行的生物标志物及用于测量锌状态的替代终点，如视网膜暗适应，以用于未来的临床研究。