微小RNA-146b-5p在小胶质细胞糖氧剥夺/复氧损伤中的作用与机制

黄 松 汪 雷 周有东 胡火军 董元训 马金阳

缺血性脑卒中是常见的脑血管疾病，占所有脑卒中的80%[1]。神经炎症被认为是缺血性脑损伤中一种重要的病理生理因素。研究表明，过度激活的小胶质细胞能够释放炎性细胞因子和加重氧化应激反应，从而导致神经元凋亡[2-4]。因此，抑制小胶质细胞活化是目前减轻缺血性脑损伤的重要研究方向。MicroRNA(miRNA)是一种长度在22nt左右的小型非编码RNA，可通过与靶基因的3’非编码区(3’-UTR)结合对mRNA的表达进行调控[5]。目前越来越多的研究表明，miRNA是多种疾病发展过程中的关键调控因子。例如，miR-146b-5p能够通过调控基质金属蛋白酶1(MMP1)的表达来抑制胶质瘤细胞的侵袭及转移[6]；miR-146b-5p可以通过调节肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)抑制乳腺癌进展[7]；miR-146b-5p可以通过TRAF6/NF-κB信号通路抑制子痫前期母胎界面的炎症反应[8]。然而，miR-146b-5p在小胶质细胞糖氧剥夺/复氧(OGD/R)损伤中的作用机制尚不完全清楚，因此，本研究通过建立小胶质细胞OGD/R体外模型，分析miR-146b-5p的表达和作用，并探究其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

小鼠小胶质细胞系EOC 13.31(CRL-2468)购自美国ATCC[9]。

1.2 试剂与仪器

原位末端标记染色(TUNEL)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒、丙二醛(MDA)ELISA试剂盒、过氧化氢酶(CAT)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒和白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒均购自武汉赛培生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自美国GlpBio公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒、PCR反转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白试剂盒购自美国Pierce公司；TRAF6抗体购自英国Abcam公司；MultiskanTMFC酶标仪购自美国ThermoFisher公司；BX63自动荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和OGD/R模型建立：将小胶质细胞系EOC 13.31放置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，5% CO2的培养箱中培养。再将细胞置于37℃，5% CO2，95% N2缺氧箱中培养2.5h后，转入正常培养环境中复氧从而建立OGD/R模型，以常规条件培养的细胞为Control组，OGD/R处理的细胞为OGD/R组，48h后收集细胞用于后续实验。

1.3.2 细胞分组及处理：将miR-146b-5p模拟物、模拟物阴性对照、miR-146b-5p抑制剂和抑制剂阴性对照分别转染至EOC 13.31细胞中，然后再分别进行OGD/R处理，记为OGD/R+miR-146b-5p mimic组、OGD/R+NC mimic组、OGD/R+miR-146b-5p inhibitor组和OGD/R+NC inhibitor组，转染48h后，进行后续相关指标的检查。

1.3.3 实时荧光定量(qRT-PCR)检测miR-146b-5p的表达：使用TRIzol试剂提取OGD/R模型中总RNA，并用PrimeScriptTMRT试剂盒将其逆转录成cDNA，使用SYBR-Green PCR试剂和ABI 7500 FAST Real-Time PCR仪进行qRT-PCR。以U6为内参，采用2-△△Ct法评估miR-146b-5p的表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.4 CCK-8检测细胞活力：收集各转染组细胞，以每孔1×103个细胞密度接种到96孔板中孵育48h，每孔加入15μl CCK-8试剂，37℃孵育4h，检测490nm波长处每个孔的OD值。根据CCK-8试剂盒说明书操作，计算细胞存活率。

1.3.5 TUNEL检测细胞凋亡率：收集各转染组细胞上清液，PBS洗涤一次。用免疫染色固定液固定细胞30-60min，PBS洗涤一次。加入免疫染色洗涤液，冰浴孵育2min。在样品上加TUNEL检测液，37℃避光孵育1h，PBS洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，随机选取5个视野，计算细胞凋亡率。

1.3.6 ELISA检测MDA、SOD、CAT、TNF-α、IL-1β和IL-6含量：收集细胞上清液与RIPA裂解液均浆离心，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定细胞中MDA、SOD、CAT、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验：通过双荧光素酶报告基因实验对miR-146b-5p与TRAF6之间的靶向关系进行验证。将含miR-146b-5p互补结合位点的野生(WT)型和突变型(MUT)TRAF6片段扩增并克隆到荧光素酶报告载体中，构建TRAF6野生型(TRAF6-WT)载体和TRAF6突变型(TRAF6-MUT)载体。使用Lipofectamine 000TM将TRAF6-WT和TRAF6-MUT分别与miR-146b-5p mimic，miR-NC mimic共转染至EOC 13.31细胞系，随后进行OGD/R处理。转染48h后，按照说明，在Dual-Luciferase®Reporter Assay System上测定各组细胞荧光素酶活性。

1.3.8 Western blotting检测TRAF6蛋白表达：收集各组细胞，用RIPA裂解缓冲液提取细胞中总蛋白，使用BCA法对蛋白进行定量，10% SDS-PAGE电泳分离转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1h，加入TRAF6一抗(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)共同孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗(1∶1 000)孵育1h后使用ECL化学发光试剂盒进行显影。以GAPDH作为内参对照。采用图像分析软件ImageJ分析TRAF6蛋白条带的灰度值。以TRAF6蛋白灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值来定量TRAF6蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-146b-5p和TRAF6在OGD/R模型中的表达

与Control组细胞相比，OGD/R组细胞中miR-146b-5p的表达显著降低(P<0.01)，TRAF6蛋白的表达显著增高(P<0.01)，差异均有统计学意义。见表2、图1。

表2 两组细胞中miR-146b-5p和TRAF6蛋白表达水平

图1 Control组和OGD/R组TRAF6蛋白表达(Westren blotting)

2.2 miR-146b-5p对OGD/R细胞增殖和凋亡的影响

与OGD/R+NC mimic组相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic组细胞存活率显著增高(t=8.322，P<0.01)，凋亡率显著降低(t=8.356，P<0.01)；与OGD/R+NC inhibitor组相比，OGD/R+miR-146b-5p inhibitor组细胞的存活率显著降低(t=9.593，P<0.01)，凋亡率显著升高(t=3.781，P<0.01)，差异均有统计学意义。见表3、图2。

表3 各组细胞存活率及凋亡率

图2 各组细胞TUNEL荧光染色图像(比例尺75μm)

2.3 miR-146b-5p对OGD/R模型氧化应激和炎症反应的影响

与OGD/R+NC mimic组相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic组细胞中MDA含量显著降低(t=13.080，P<0.01)，SOD、CAT含量显著增高(t=6.907、5.376，P<0.01)，TNF-α，IL-1β，IL-6含量显著降低(t=3.383、4.476、7.561，P<0.05或P<0.01)；与OGD/R+NC inhibitor组相比，miR-146b-5p inhibitor组细胞中MDA含量显著增高(t=6.460，P<0.01)，SOD、CAT含量显著降低(t=6.326、4.449，P<0.01)，TNF-α，IL-1β和IL-6含量显著升高(t=5.154、3.905、6.467，P<0.05或P<0.01)，差异均有统计学意义。见表4、表5。

表4 各组细胞氧化应激指标水平

表5 各组细胞炎症反应指标水平

2.4 miR-146b-5p与TRAF6的关系

通过TargetScan数据库发现，miR-146b-5p与TRAF6的3’UTR区存在互补结合位点(图3)。双荧光素酶报告实验结果表明，与OGD/R+NC mimic组相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic组中含TRAF6-WT的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，而对含TRAF6-MUT组则无影响(P>0.05)，见表6。Western blotting结果表明，与OGD/R+NC mimic组相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic组TRAF6蛋白表达显著降低(t=7.723，P<0.01)；OGD/R+NC inhibitor组相比，OGD/R+miR-146b-5p inhibitor组TRAF6蛋白表达显著增加(P<0.01)，差异有统计学意义。见图4、表7。

图3 miR-146b-5p与TRAF6存在结合位点

表6 两组TRAF6双荧光素酶活性

图4 各转染组中TRAF6的蛋白表达水平(Westren blotting)

表7 各组TRAF6蛋白相对表达量

3 讨 论

缺血性脑损伤的发病率和致死率极高，因此，缺血性脑损伤的基础和临床研究一直是研究和关注的热点。缺血性脑损伤中最重要的病理机制之一就是炎症反应和氧化应激[10]。抑制炎症反应和氧化应激对减少缺血性脑损伤具有重要意义。

众所周知，小胶质细胞是大脑中主要的免疫细胞，小胶质细胞的激活被认为是神经炎症反应的一个特征，参与多种脑疾病的发病机制。研究表明，mRNA作为内源性RNA，主要通过形成功能性miRNA诱导的沉默复合物来抑制mRNA翻译或诱导其降解，进而参与到生理反应的调节中[11，12]。miR-146b-5p在神经胶质瘤中抑制了神经胶质瘤的增殖并促进其凋亡[13]。另外，在新生儿缺血性脑病中，miR-146b-5p靶向IRAK1，可降低炎性因子和氧化应激的表达，减轻神经元损伤[14]。本次研究发现miR-146b-5p在小胶质细胞OGD/R模型中显著下调，miR-146b-5p模拟物可显著促进小胶质细胞OGD/R模型细胞增殖并抑制细胞凋亡、炎症反应和氧化应激。miR-146b-5p抑制剂则显示出相反的效果。生物信息学和双荧光素酶报告基因实验显示在小胶质细胞OGD/R模型中，TRAF6是miR-146b-5p的下游靶基因。TRAF6是TRAF家族中的一员，在催化反应中可以通过硫酯键与泛素结合，并将泛素传递到相应底物，从而参与一系列信号转导。TRAF6与免疫和中枢神经系统疾病(如卒中，颅脑外伤，神经退行性疾病和神经性疼痛)密切相关，研究报道TRAF6可以通过Toll受体4(TLR4)和NF-κB/MAPK信号通路，在免疫和炎症反应中起着非常重要的作用[15，16]。TRAF6通过抑制自噬和促进氧化应激影响了蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的程度[17]。本研究发现在小胶质细胞OGD/R模型中，miR-146b-5p可与TRAF6结合并负向调控TRAF6的表达。

总之，本研究发现miR-146b-5p通过负向调控TRAF6蛋白表达水平保护小胶质细胞OGD/R损伤，该研究为小胶质细胞OGD/R损伤提供了一个潜在的靶点。

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