丙泊酚基于SIRT1/Foxo1信号缓解脑缺血再灌注造成血脑屏障损伤*

肖志博 谢 海 金 辉 王 健 陈 锐

缺血性脑卒中是一类常见的脑血管疾病，具有高致残率和高致死率的特点[1]。缺血性脑卒中会造成血脑屏障破坏，恢复缺血区血供是其首要治疗方案。然而，血脑屏障破坏后外周血携带大量神经毒素，与血液复灌过程一同造成再灌注损伤。故寻找和开发避免血脑屏障损伤的有效药物有助于减轻再灌注损伤。

丙泊酚是脑损伤外科常用的静脉麻醉药物，具有放缓血流速率，减少脑耗氧量，降低颅内压的作用。近年来，大量研究显示丙泊酚对脑缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)发挥脑保护作用[2,3]。SIRT1/Foxo1(Silent Information Regulator 1/Forkhead Box O1)为中枢神经保护相关的信号通路之一。SIRT1是哺乳动物中一类蛋白去乙酰化酶，可以通过使组蛋白和非组蛋白如 Foxo1 和 p53 去乙酰化来调节炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和自噬，同时可以促进内皮一氧化氮合酶合成，诱导动脉扩张来阻断缺血和灌注带来的损伤[4,5]。关于丙泊酚对I/R过程中血脑屏障完整性和SIRT1/Foxo1信号通路的影响鲜有报道，本研究通过构建大鼠I/R模型，探讨丙泊酚对血脑屏障的影响及可能机制，为临床药物应用提供一定理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量(230±10)g，48只，8周龄，由海南省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(琼)2020-0007。饲养于室温(23±2)℃，湿度(60±5)%，昼夜循环12h/12h的环境中。动物自由饮食，适应环境1周后开展实验。

1.2 实验材料

丙泊酚注射液(西安力邦制药有限公司，批号：20190330，规格: 100mg/10ml)；SIRT1抑制剂EX527(美国MedChemExpress公司，批号：M245837，规格：10mg)；大鼠脑卒中线栓(美国Doccol公司，型号：403556PK5Re)；2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京索莱宝生物技术公司)；伊文思蓝溶液(Evans Blue，EB，Sigma-Aldrich，美国)；鼠源IL-1β，IL-6试剂盒(杭州联科生物技术公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术公司)；Anti-Occludin抗体、Anti-Claudin-1抗体、Anti-ZO-1抗体、NLRP3抗体、β-actin抗体(武汉三鹰生物科技公司)；Anti-SIRT1、Anti-Foxo1、Anti-Ac-Foxo1(美国Affinity公司)；HRP Anti-rabbit/mouse IgG(H+L)二抗(上海碧云天生物科技公司)。

1.3 动物分组和处理

将48只大鼠随机分为假手术组(Sham组)，脑缺血再灌注组(I/R组)，脑缺血再灌注+丙泊酚组(I/R+Propofol组)和脑缺血再灌注+丙泊酚+ EX527(I/R+Propofol+EX527组)，每组各12只。I/R模型构建前，取Propofol+EX524组大鼠蛛网膜下腔注射给药SIRT1抑制剂EX527，剂量5mg/kg，每2天一次，共4次。脑缺血过程中，取各组大鼠，根据分组情况，分别尾静脉注射10mg/kg丙泊酚[6]或2 ml 生理盐水。Sham组大鼠麻醉后，分离出颈动脉，缝合伤口。

1.4 I/R模型[7]构建

3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台上。切开大鼠颈部左侧皮肤，分离出颈动脉，结扎左侧颈总动脉、颈外动脉。颈总动脉穿刺开孔，插入脑卒中线栓，前进至大脑中动脉，约16mm。此时大鼠根据分组，尾静脉注射丙泊酚溶液或生理盐水，保持中动脉血液封闭120min，取出线栓，随后缝合伤口。

1.5 观察指标和方法

I/R模型构建24h后，取各组大鼠评估神经功能，取大鼠脑脊液与脑组织，用于评估大鼠脑梗死体积，血脑屏障结构完整性，炎性细胞因子含量，血脑屏障完整性相关蛋白与SIRT1/Foxo1相关蛋白。

1.5.1 神经功能障碍评分[8]：对所有大鼠的神经功能开展评估，分为提尾试验、运动试验、感觉试验、平衡木试验、反射丧失和不正常运动测试，严重程度评分由0分至18分，其中0分代表正常，评分越高代表神经功能损伤越严重。

1.5.2 大鼠脑组织梗死体积染色(TTC染色)：每组取3只大鼠，处死后取脑组织，冰箱中冷冻后切成4片，浸没于2% TTC溶液中，37℃水浴中避光孵育，每5min翻动一次切片，共30min。取出脑组织切片，按顺序排列后拍照，以白色梗死区域体积占脑组织体积比例(%)作为最终结果。

1.5.3 血脑屏障通透性评价：每组取3只大鼠，尾静脉注射2% EB溶液(3ml/kg)。待EB在大鼠各器官中分布2h，处死并取脑组织，沿脑中线切开，分别加入50%三氯乙酸匀浆。25℃下，离心(12 000rpm，20min)后收集上清液，于620nm波长处检测吸光值(OD值)。取同批次非手术大鼠脑组织，匀浆后离心取上清液，加入不同浓度EB溶液检测吸光值作为实验标准曲线。通过该标准曲线确定各组大鼠脑组织中EB含量，结果以μg/g表示。

1.5.4 ELISA法检测炎性细胞因子：每组取6只大鼠，通过枕骨大孔穿刺取脑脊液。将脑脊液与样品稀释液按1∶9稀释，在预包被IL-1β或IL-6抗体的ELISA板中加入各组样品与IL-1β或IL-6检测抗体，室温孵育1.5h。清洗各个样品孔后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，室温孵育30min。清洗各个样品孔后加入显色底物TMB，室温避光孵育5min，加入终止反应液，5-10min内在450nm处检测最大吸收波长。

1.5.5 Western blotting检测脑组织相关蛋白表达：每组取3只大鼠，处死后取缺血侧基底层组织，加入RIPA裂解液匀浆，静置30min。4℃离心(12 000rpm, 30min)吸取上清液，测试蛋白浓度并加入上样缓冲液，加热10min使蛋白变性。取凝胶上样并开启电泳，通过湿法转膜法转移凝胶条带蛋白至PVDF膜上。取出PVDF膜，脱脂奶粉封闭，分别加入一抗、二抗稀释液孵育。ECL显色反应后，化学发光成像仪下获得各个蛋白条带，分别以β-actin和Foxol作为内参，以目的蛋白条码及actin条带灰度值的比值表示各蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠神经功能障碍评分

Sham组大鼠未表现出神经功能损伤情况，其余各组大鼠神经功能障碍评分均较Sham组出现了不同程度的增加，即神经功能损伤(P<0.05)；与Sham组相比，I/R组神经功能障碍评分明显增加(t=9.40，P<0.05)；与I/R组相比，I/R+Propofol组大鼠神经功能障碍评分明显减少(t=4.20，P<0.05)；与I/R+Propofol组相比，I/R+Propofol+EX527组大鼠神经功能障碍评分增加(t=3.40，P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠脑梗死体积比例

Sham组大鼠脑组织正常，没有梗死区域出现，其余各组大鼠脑组织都出现了不同体积的梗死区域；与I/R组相比，I/R+Propofol组大鼠脑梗死体积明显减少(t=18.00，P<0.05)；与I/R+Propofol组相比，I/R+Propofol+EX527组大鼠脑梗死体积明显增加(t=11.70，P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠神经功能障碍评分和脑梗死体积比率比较

2.3 大鼠血脑屏障通透性

各组大鼠脑组织硬死体积比例差异均有统计学意义(P<0.05)。Sham组大鼠左右脑EB含量较低，与Sham组相比，I/R组大鼠左脑和右脑中EB含量都明显增加(t=12.80、3.60 ，P<0.05)，即血脑屏障结构完整性被破坏；与I/R组相比，I/R+Propofol组大鼠左脑中EB含量明显减少(t=6.00,P<0.05)，右脑中EB含量减少不明显(t=0.84,P>0.05)；与I/R+Propofol组相比，I/R+Propofol+EX527组大鼠左脑中EB含量明显增加(t=2.70,P<0.05)，右脑中EB含量增加不明显(t=0.42,P>0.05)。见图1和表2。

图1 各组大鼠脑梗死染色图(TTC)

表2 各组大鼠脑组织中EB含量比较

2.4 各组大鼠脑脊液中IL-1β与IL-6含量比较

各组大鼠脑脊液中IL-1β和IL-6含量差异均有统计学意义(P<0.05)。与Sham组相比，I/R组脑脊液中IL-1β、IL-6含量明显升高(t=35.57、18.6,P<0.05)；与I/R组相比，I/R+Propofol组IL-1β、IL-6含量明显降低(t=32.70、14.10,P<0.05)；与I/R+Propofol组相比、I/R+Propofol+EX527组IL-1β、IL-6含量明显升高(t=29.20、13.70,P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑脊液中IL-1β、IL-6含量比较

2.5 大鼠脑组织中血脑屏障相关蛋白表达

各组大鼠脑组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。与Sham组相比，I/R组脑组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达明显降低(t=13.76、9.80、27.30,P<0.05)；与I/R组相比，I/R+Propofol组脑组织中Claudin-1、 Occludin、 ZO-1蛋白表达明显增加(t=13.30、8.90、15.80,P<0.05)；与I/R+Propofol组相比，I/R+Propofol+EX527组脑组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达明显减少(t=14.30、13.00、17.20,P<0.05)。见图2和表4。

图2 各组大鼠脑组织中血脑屏障相关蛋白表达

表4 各组大鼠脑组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达量

2.6 大鼠脑组织中SIRT1/Foxo1信号蛋白表达

各组大鼠脑组织中SIRT1/Foxo1信号相关蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。与Sham组相比，I/R组脑组织基底层中SIRT1蛋白表达明显降低(t=10.30,P<0.05)，Ac-Foxo1和NLRP3表达明显增加(t=14.00、12.10,P<0.05)；与I/R组相比，I/R+Propofol组脑组织中SIRT1蛋白表达明显增加(t=17.70，P<0.05)，但Ac-Foxo1和NLRP3表达明显减少(t=12.80、9.30,P<0.05)；与I/R+Propofol组相比，I/R+Propofol+EX527组脑组织中SIRT1蛋白表达明显减少(t=19.50,P<0.05)，而Ac-Foxo1和NLRP3表达明显增加(t=10.70、8.60,P<0.05)。见图3和表5。

图3 各组大鼠脑组织中SIRT1/Foxo1信号蛋白表达(Western blotting)

表5 各组大鼠脑组织中SIRT1/Foxo1信号蛋白表达量化统计比较

3 讨 论

神经炎症反应、血脑屏障结构破坏、神经元死亡均是I/R过程中可能出现的情况，终点指向神经功能损伤的病理机制[9]。本研究采用了Longa线栓法制备大鼠I/R模型，该方法模拟了患者因血栓形成，突发局部缺血的情况。脑缺血2h后通过拔出线栓恢复缺血区的血供，模拟溶栓后再灌注过程造成脑神经元损伤。结果显示，与Sham组相比，I/R组大鼠出现神经功能损伤、血脑屏障破坏、脑组织局部梗死。这些症状与文献中I/R损伤动物模型表现一致[10]，且与临床患者症状[11]相似，表明大鼠I/R模型构建成功。

丙泊酚作为一种全身静脉麻醉药物，具有起效快，苏醒迅速，剂量易控制且不良反应较少的优点，被广泛应用于手术的麻醉和镇静过程。不少研究显示，低剂量丙泊酚具有神经保护作用。Zhang等[12]研究显示，丙泊酚通过下调Cx43抑制小胶质细胞活化，减少炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，发挥抗I/R损伤的作用。另一项研究也有显示，丙泊酚的干预对大鼠脑组织I/R损伤提供了一个长期的保护，主要是通过提高AMPA受体GluR2亚基的表达促进神经元新生[13]。本研究结果显示，丙泊酚干预明显减少了大鼠脑梗死区域，抑制了炎症反应，保护了血脑屏障结构与功能完整，改善了大鼠神经功能。证实丙泊酚为大鼠脑组织I/R损伤提供了明显的保护作用。

血脑屏障是由脑组织中连续毛细血管内皮细胞及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞以及星形胶质细胞脚板围成的神经胶质膜构成，其中内皮是血脑屏障的主要结构。血脑屏障通过维持低水平的转胞吞作用，保证脂溶性物质顺利通过的同时减少神经毒性物质和水分子的进入。脑缺血早期，由于血氧供应阻断，破坏血脑屏障结构中内皮细胞完整性[14]。紧密连接是脑血管内皮细胞间各种紧密连接蛋白组成结构，其中Claudin-1形成了屏障的初级结构，Occludin和ZO-1则进一步加强其牢固性。紧密连接蛋白的表达降低进一步破坏了血脑屏障，直接参与了I/R的病理过程并加剧I/R损伤[15]。Wei等[16]研究结果同样表明，Claudin-1、Occludin与ZO-1表达和分布的改变能够影响紧密连接的稳定性，进而造成脑损伤。本研究结果显示，I/R组大鼠脑组织中Claudin-1、Occludin与ZO-1表达降低，且伊文思蓝通过量增加，提示I/R组大鼠血脑屏障遭受破坏。然而，在丙泊酚的干预下，Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达明显增加，且伊文思蓝通过量明显减少。因此，丙泊酚对I/R大鼠血脑屏障结构与功能完整性具有明显保护作用。

SIRT1 在涉及认知功能和基因表达调节的各个大脑区域中高度表达。作为SIRT1的下游靶标，Foxo1已被证实可以在Lys294亚基位点处被SIRT1去乙酰化[17]。Zhao等[18]调查研究显示，SIRT1/Foxo1信号通路的激活能够明显抑制神经元自噬，改善离体研究中糖氧剥夺诱导的神经元活性与在体研究中动脉缺血造成的神经功能损伤。Lv等[19]研究显示，SIRT1表达增加在下调Ac-Foxo1的同时抑制脑组织炎症反应，从而改善神经元内环境，维持大鼠缺血区神经元的存活。此外，Yang等[20]研究显示，SIRT1/Nrf2/HO-1 信号通路活化能够保护MCAO大鼠血脑屏障免受氧化应激的损伤，但在SIRT1抑制剂EX527干预下，血脑屏障完整性与神经功能的保护作用被逆转。因此，SIRT1信号通路与脑组织炎症反应和血脑屏障的完整性相关。本研究结果显示，丙泊酚明显增加了SIRT1表达，提高了对Ac-Foxo1的去乙酰化作用，介导炎症小体NLRP3表达降低。然而，Ex527明显削减了丙泊酚的保护作用，具体表现为SIRT1表达降低，Ac-Foxo1与NLRP3的表达增加，与此同时，大鼠的脑脊液中炎性细胞因子增加，且脑组织中EB含量、脑梗死区域、神经功能障碍评分增加。

综上所述，丙泊酚对I/R大鼠具有明显保护作用，其机制涉及SIRT1的活化，增加Ac-Foxo1的去乙酰化，从而减少炎性细胞因子的释放，维持血脑屏障的完整性。最近，内皮细胞增殖被发现与缺血性中风血脑屏障完整性相关[21, 22]，因此，未来研究中将继续探究SIRT1/Foxo1在内皮细胞增殖、分化中的作用。

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