早期肥胖大鼠与早期糖尿病大鼠空肠病变比较研究*

耿旭芳 王 嫚 祗明花 王亚文 段晓峰 侯聪聪 李 丽 赵 丁

河北医科大学药学院，河北省石家庄市 050017

糖尿病和肥胖等代谢性疾病发病率日益增加，已成为全球性的公共卫生问题。胃肠道有可能是代谢性疾病的发源地，由于糖尿病和肥胖患者胃肠病变的发病率极高，普遍伴随腹泻、便秘、腹痛和大便失禁等症状[1-2]，可能会引起肠道结构及功能的变化[3-4]。由于肠道的复杂性，尤其是各种不同类型代谢性疾病的肠道病变研究甚少，导致临床治疗的针对性不足，甚至被忽视。

肠道不仅是机体消化、吸收营养物质的主要场所，也是机体重要的防御屏障。其屏障能够有效地防止肠内细菌、毒素等有害物质进入机体，而肠黏膜屏障在其中发挥着关键作用。有研究表明，肥胖和糖尿病引起的肠道病变与肠黏膜屏障的完整性丧失、肠道的通透性发生变化有密切关系，从而导致有害物质直接进入组织器官甚至循环系统，对机体造成严重损害[5]。近年来，众多学者倡导疾病的早期发现、早期治疗及早期预防的新思路，对于糖尿病的防治具有重大意义。因此，研究早期2型糖尿病(T2DM)、早期1型糖尿病(T1DM)及早期饮食引起的肥胖大鼠空肠病变的差异，可为相关代谢疾病引发肠道病变的机制提供研究思路，并可为肥胖、T2DM、T1DM肠道病变的早期干预提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物及分组：实验动物采用SPF级SD雄性大鼠，鼠龄5～6周，40只，由河北省实验动物中心提供，合格证号：CXK(冀)2013—1003。动物于IVC型独立送风隔离笼具进行分笼饲养。大鼠适应性喂养后，随机分为对照组、早期肥胖组、早期T2DM组、早期T1DM组，各10只。(2)仪器：血糖仪及血糖试纸(雅培制药有限公司)；石蜡切片机(RM2135，LEICA公司)光学显微镜(CX31，OLYMPUS公司)；成像分析软件[ISCapture(V3.5)，深瞳光电科技有限公司]。(3)试剂：链脲佐菌素(STZ，Cayman Chemical公司，批号：061002)；苏木精(上海市化学试剂公司)；伊红(北京化工厂)；Zona Occludens 1(ZO-1，Abcam公司，批号：ab216880)；Anti-Occludin antibody(Occludin，Abcam公司，批号：ab222691)；生物素—链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；浓缩型DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；高脂饲料(北京博泰宏达生物技术有限公司，脂肪所占热量比为34%)；普通饲料(河北医科大学实验动物中心，脂肪所占热量比为13%)。

1.2 方法

1.2.1 造模：早期肥胖组大鼠喂养高脂饲料，以肥胖度≥20%为造模成功，肥胖度计算公式：肥胖度(%)=(实验组实际体重-对照组平均体重)/ 对照组平均体重×100%，造模成功后继续高脂饲料喂养2周[6]；早期T2DM组大鼠高脂饲料喂养后，腹腔注射低剂量链脲佐菌素(STZ，30mg/kg)，以空腹血糖≥11.8mmol/L为造模成功，并继续以高脂饲料喂养2周[7]；早期T1DM组大鼠喂养普通饲料，腹腔注射高剂量链脲佐菌素(STZ，60mg/kg)，以空腹血糖值≥16.7mmol/L为造模成功，并继续喂养2周[8-9]；对照组大鼠喂养普通饲料并给予等量生理盐水。

1.2.2 HE染色：实验前将大鼠禁食12h，自由饮水。实验时尾静脉取血测定空腹血糖，处死，取空肠组织置于固定液中固定24h，梯度浓度乙醇脱水，浸蜡，包埋，制作成石蜡切片，将组织切片进行脱蜡，水化，透明，苏木精—伊红染色，封片。

1.2.3 免疫组化染色：将组织切片进行脱蜡、水化；将切片浸入抗原修复液中加热后冷却；滴加过氧化氢，用山羊血清封闭；加入一抗ZO-1(1∶100)、Occludin(1∶100) 4℃过夜；加入二抗，PBS冲洗；DAB显色；苏木精染核；脱水、透明、封片。

1.3 观察指标 将各组大鼠禁食12h，测定各组大鼠造模前、成模后、成模后1周、成模后2周的空腹血糖；采用光学显微镜观察空肠组织切片的组织形态结构变化，利用ISCapture(V3.5)成像分析软件测量内环肌、外纵肌、黏膜下层的厚度及空肠绒毛、腺体的长度并计算绒腺比；空肠组织切片经免疫组化染色后，观察紧密连接蛋白ZO-1与Occludin表达。

2 结果

2.1 血糖 实验前各组大鼠血糖无显著差异；成模后、成模后1周和成模后2周，对照组与早期肥胖组大鼠血糖无显著差异，早期T2DM组与早期T1DM组比对照组大鼠血糖升高(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠血糖变化比较

2.2 HE染色 根据HE染色结果显示，对照组大鼠空肠黏膜完整，早期肥胖组大鼠绒毛排列整列、完整；早期T2DM组大鼠绒毛杂乱无序，长短不一；早期T1DM组大鼠绒毛杂乱无序，大量绒毛断裂。统计结果显示，各组间大鼠空肠组织的外纵肌和内环肌的厚度无显著差异；早期T2DM组和早期T1DM组黏膜下层厚度均有增加(P<0.05,P<0.01)；各组大鼠空肠组织的绒腺比无明显差异，见表2、图1。

图1 空肠组织形态变化

表2 各组大鼠空肠形态结构变化比较

2.3 免疫组化染色 免疫组化染色结果显示，与对照组相比，早期肥胖大鼠空肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达明显增加(P<0.05)，而T2DM大鼠空肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达量无明显变化；T1DM大鼠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达明显减少(P<0.01)，见图2。

3 讨论

肥胖和糖尿病等代谢性疾病常伴随着肠道病变[10]，其主要的病理特征为肠黏膜屏障受损，小肠上皮细胞紧密连接蛋白表达异常，导致肠道通透性增加，细菌发生移位，释放大量炎症因子，危害患者生命健康，因此，探究糖尿病、肥胖等代谢性疾病导致肠道不同的病理变化至关重要。本研究中，早期肥胖组大鼠空肠绒毛排列整齐、完整，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达增加；早期T2DM组大鼠空肠绒毛杂乱，长短不一，肠黏膜下层增厚，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达无显著变化；早期T1DM大鼠空肠绒毛杂乱无序、断裂，绒毛表面积减少，肠黏膜下层增厚，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达降低。研究结果显示，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin在早期肥胖大鼠中表达增多，早期T1DM中表达降低，而在早期T2DM大鼠空肠中其表达介于早期肥胖与早期T1DM大鼠之间，推测可能是由于T2DM存在高脂饮食和血糖升高两因素，一方面导致肠黏膜下层增厚影响空肠功能，另一方面在影响空肠紧密连接蛋白表达方面相互拮抗，而使其病理变化差异不显著。

图2 空肠组织ZO-1、Occludin表达量变化

综上所述，早期糖尿病与高脂诱导的肥胖均可导致空肠形态结构改变，肠黏膜屏障受损，紧密连接蛋白表达出现差异性变化，揭示了不同类型代谢性疾病早期空肠不同的病理变化，为肠道病变的早期干预，提供重要实验依据与研究思路。