四妙丸治疗血栓性浅静脉炎的网络药理学机制研究

公 瑞，刘 湘，张 玥，程志新，殷 璇

血栓性浅静脉炎（superficial thrombophlebitis，STP）是指发生于四肢、胸腹壁浅静脉的血栓性、炎症性疾病，在人群中的发病率高达3%～11%[1]。若不及时治疗，其血栓可向近端或者深静脉系统蔓延，导致深静脉血栓形成，甚至引发肺栓塞[2]。本病属于中医学“恶脉”“青蛇毒”等范畴，其主要病机为热毒、水湿和血瘀阻于脉络。故中医治以清热利湿、活血通脉为主。四妙丸由黄柏、苍术、薏苡仁、川牛膝组成，善治湿热下注、下焦肿痛诸证。多项临床研究表明四妙丸加味治疗STP 疗效显著[3-5]，但是其治疗STP 的具体作用机制还需进一步探究。

网络药理学以高通量的方式从中药复方中筛选出协同增效的化合物，具有“数据量大、分析便捷、结果准确”的特征[6]。本文拟运用网络药理学方法及分子对接技术，整合分析数据库中药物与疾病的信息，构建药物-靶点-疾病网络，进行分子对接验证，以探讨四妙丸治疗STP 的作用机制。

1 资料与方法

1.1 四妙丸有效成分筛选 通过检索TCMSP 数据库[7]获取四妙丸中薏苡仁、黄柏、苍术、牛膝的有效成分，按照口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的条件对有效成分进行筛选。

1.2 有效成分作用靶点获取 通过TCMSP 数据库挖掘有效成分的作用靶点，并通过Uniprot 数据库将作用靶点的名称作标准化处理。

1.3 STP 靶点的获取 使用Genecards（https://www.genecards.org/）数据库 和OMIM（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）数据库，分别检索并获取STP 相关靶点，在CTD 数据库[8]中以“Inference Score≥10”为条件对获得的靶点进行筛选，获得与STP 相关的靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建通过Excel 将1.2 中的靶点与1.3 中的靶点取交集，去除重复值后得到四妙丸治疗STP 的关键靶点。通过STRING 数据库对蛋白质之间的相互作用进行预测，得到关键靶点之间的关系。STRING 数据库系统可对通过不同方式获得的预测结果进行评分，分值越高，表示PPI 结果的置信度越高。

1.5 构建药物-成分-靶点-疾病网络图 使用Cytoscape 3.7.2 软件（http://www.cytoscape.org）构建“药物-成分-靶点-疾病”关系网络。网络中的节点（node）分别代表中药、成分、靶点与疾病，节点之间通过边（edge）来连接。根据节点度值（degree）的大小筛选出网络的核心节点。

1.6 四妙丸治疗STP 通路富集分析 运用Cytoscape3.7.2 中CluoGO v 2.5.5插件GO Biological Process 来分析四妙丸有效成分治疗STP靶点生物过程，运用KEGG 以“P＜0.01”对获取的治疗STP 的通路进行富集分析。

1.7 核心成分与靶点的分子对接验证 对1.5 中通过构建网络图筛选得到的核心成分与靶点进行分子对接。从RSCB PDB 数据库（https://www.rcsb.org）中下载获取核心靶点蛋白PDB 格式的3D 结构文件。从TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmspsearch.php）中下载获取核心成分的mol2 格式文件。运用AutoDockTools 1.5.6 软件对靶蛋白和小分子配体进行对接前的预处理。运用Autodock vina 1.1.2 进行对接及结合能的计算，进而分析其结合活性。利用Pymol 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 四妙丸药物入血活性成分筛选 通过TCMSP数据库检索新处方药物有效成分，以OB ≥30%和DL ≥0.18 为条件筛选出四妙丸活性化合物60个，其中薏苡仁9 个，川牛膝4 个，苍术9 个，黄柏38 个。

2.2 有效成分作用靶点 获取黄柏有效成分作用靶点132 个，川牛膝106 个，薏苡仁44 个，苍术48 个。将靶点合并去除重复值后，共获得132 个作用靶点。

2.3 STP 相关靶点 在GeneCards、OMIM 数据库中筛选出STP 相关靶点143 个，在CTD 数据库中筛选出STP 相关靶点共4086 个，将靶点合并去除重复值后，共获得相关靶点4148 个。

2.4 PPI 网络构建与分析 经过取交集并去除重复值后，获得关键靶点94 个，并绘制维恩图（图1）。在STRING 数据库中输入关键靶点，获得关键靶点的PPI 网络（图2）以及靶点之间的关系。该网络共包含节点94 个，边813 条，平均度值为17.3。按照节点度值设置，度值越高表示该节点越重要，其所代表的靶点在网络中的作用也就越高,表明这些靶点可能在四妙丸治疗STP 的过程中起关键作用。

图1 四妙丸有效成分作用靶点与STP 相关靶点交集

图2 关键靶点PPI 网络

2.5 药物-成分-靶点-疾病网络构建 运用Cytoscape 3.7.2 构建药物-成分-靶点-疾病网络，见图3。网络由143 个节点组成，其中4 个中药节点、44 个成分节点、94 个靶点节点和1 个疾病靶点，六边形代表中药节点，椭圆形代表疾病节点，菱形代表靶点节点，矩形代表成分节点。节点的Degree 值越大，说明节点在网络中的重要性越大。根据Degree 值大小筛选出核心成分和靶点(表1)，结果表明，槲皮素（MOL000098）、β 谷甾醇（MOL000358）等有效成分以及雄激素受体（androgen receptor,AR）、雌激素受体1（estrogen receptor，ESR1）、凝血酶Ⅱ（thrombin，F2)等靶点度值较高，说明这些有效成分和靶点在网络中的作用显著，是和其他靶点互通的纽带。

表1 四妙丸治疗STP 的核心节点

图3 四妙丸治疗STP 的药物-成分-靶点-疾病网络

2.6 药物-成分-靶点-疾病通路分析 通过ClueGO 将四妙丸治疗STP 的生物过程和通路进行分析，运用GO Biological Process 并选择P＜0.01的生物过程，共214 条，关键靶点富集显著的前5条生物过程（表2）为对药物的反应（48 个靶点），对有机环状化合物的反应（44 个靶点），对氮化合物的反应（33 个靶点），细胞对有机环状化合物的反应（32 个靶点），细胞对有机氮化合物的反应（30个靶点）。证明四妙丸治疗STP 的作用可通过参与多种生物过程而达到。

运用KEGG 进行通路富集分析，以P＜0.01共得到29 通路。结果见图4。结果表明，白细胞介素-17（interleukin 17，IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、松弛素（relaxin，RLX）信号通路及C 型凝集素受体（c-type lectin receptor，CLR）信号通路等通路是关键靶点显著富集的通路。

图4 KEGG 获得的药物-成分-靶点-疾病通路

2.7 核心成分和核心靶点分子对接 在“药物-成分-靶点-疾病”关系网络中筛选出四妙丸核心成分2 个[槲皮素（MOL000098），β 谷甾醇（MOL000358）]以及3 个核心靶点（ESR1、AR、F2）进行分子对接。对接靶点基因的PDB ID 和结合能等信息见表3，对接结合位点见图5，其中槲皮素与ESR1 的连接（图5A）,槲皮素与AR的连接（图5B），槲皮素与F2 的连接（图5C），β 谷甾醇与ESR1 的连接（图5D），β 谷甾醇与AR 的连接（图5E），β 谷甾醇与F2 的连接（图5F）。核心成分与靶点之间可通过氢键连接，图中黄色虚线即是氢键。若结合能＜-7.0 kcal·mol-1，则提示结合活性较好[9]，分子对接结果表明，活性成分槲皮素、β 谷甾醇与核心蛋白ESR1、AR、F2 之间的相互作用力及结合亲和力较强，具有潜在的研究价值。

图5 四妙丸核心成分与其治疗核心靶点的分子对接

表3 四妙丸核心成分与靶点的分子对接结果

3 讨论

血栓性浅静脉炎是指由于各种原因导致血液滞留在浅静脉内发生异常凝固，进而阻塞浅静脉，引起血液回流障碍，使沿浅静脉走行部位出现红、肿、热、痛的急性非化脓性炎症[10]。中医认为本病多由湿热蕴结、寒湿凝滞、痰浊瘀阻、脾虚湿蕴、外伤血脉等因素致使湿邪下注于脉络，日久郁而化热，煎熬血液而成瘀，导致气血运行不畅，脉络滞塞不通而发病[11]。故湿热瘀结是其主要的病机特点。四妙丸出自清代张秉成的《成方便读》，方中以黄柏为君药，取其寒以胜热，苦以燥湿，且善除下焦之湿热。苍术温燥利湿，薏苡仁健脾燥湿散结，共为臣药。牛膝活血通经络，且引药直达下焦，为佐药[12]。四药配伍苦寒温燥相制，长于下焦，药简而效专，共奏清热利湿、活血解毒之功。现代药理表明，黄柏具有抗菌、消炎、解热和镇痛等作用[13]。苍术具有抗肿瘤、抗炎和抗过敏等作用。薏苡仁具有抗凝血、抗肿瘤、降血糖和抗炎等作用[14]。牛膝具有扩张血管、改善循环、抗炎和消肿等作用[15]。研究结果显示，槲皮素、β-谷甾醇等为四妙丸治疗STP 的核心成分，可通过作用于AR、ESR1、F2 等核心靶点和参与IL-17 信号通路、TNF 信号通路、RLX 信号通路、CLR 信号通路等达到治疗STP 的作用。

3.1 四妙丸的有效成分 槲皮素属于黄酮醇类物质，其存在于苹果、洋葱、槐米等水果、蔬菜以及中药中，研究表明其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒作用，特别是抗炎作用与其他药理活性密切相关[16-18]。李林蔓等[19]通过研究槲皮素对于急性喉炎模型大鼠炎性反应的影响机制，发现槲皮素可通过提高Treg 细胞分化、降低Th17细胞分化进而恢复Th17/Treg 平衡以及提高HO-1的表达水平和活性，从而改善急性喉炎模型大鼠喉部组织的炎性。孙军等[20]发现槲皮素可通过直接激活氧化应激下的血管内皮细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）下游的PI3K/Akt 信号通路，对过氧化氢（H2O2）诱导EPCs 氧化应激损伤起到修复作用。β-谷甾醇是植物中甾醇类成分之一，广泛存在于植物油和坚果等植物种子中，主要有降血脂、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用[21]。Choi等[22]证实β-谷甾醇能够减少TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，发挥其抗炎作用。

3.2 关键靶点 AR、ESR1、F2 等是四妙丸作用于STP 的核心靶点，AR 是一种配体依赖性的反式转录调节蛋白，主要分布在靶细胞的核内，是参与雄激素在靶细胞中发挥作用的重要组成部分。研究表明睾酮是一种雄激素，由胆固醇合成，具有抑制炎症、扩张冠状动脉的功能，由于睾酮主要与AR 通过基因及非基因效应发挥生物学效应，雄激素-AR 系统可对抗缺血缺氧对血管系统造成的改变，故AR 具有保护血管系统的作用[23]。罗秀梅等[24]研究表明：血小板Aβ 的过度生成可导致血管内皮细胞凋亡，而ESR1 可抑制血小板Aβ的生成，进而防止血小板Aβ 过度生成对血管内皮细胞造成的毒性作用，从而达到保护血管内皮细胞的作用。F2 是凝血级联反应中的关键酶，可以将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，激活凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅺ和Ⅻ，进而活化血小板,增强血管通透性，发挥其炎症介质作用[25]。分子对接结果部分验证了四妙丸治疗STP 的多靶点协同作用机制。

3.3 信号通路 IL-17 作为强大的促炎性细胞因子，可以经过活化中性粒细胞和引导分泌前炎症因子从而产生炎症作用[26]。研究表明，TNF-α 作为炎性细胞因子的重要成员，可促使炎症细胞活化，诱导黏附分子和趋化因子的分泌，是诱导炎症反应发生的主要细胞因子[27]。二者作为炎性细胞因子，具有协同性[28]。IL-17 可以增多巨噬细胞生成TNF-α 和IL-1，从而进一步增强炎症反应[29]。因此，四妙丸可以通过以上2 种通路发挥抗炎作用，从而减轻STP 的炎症反应。RLX 是一种新型的肽类激素，研究表明RLX 可以引起内皮源性血管扩张，降低血管阻力、抑制炎性因子黏附，从而改善血管功能[30]。在大鼠和豚鼠的炎性反应模型中，松弛素通过一氧化氮的产生介导抑制肥大细胞释放组胺[31]。此外有研究表明松弛素可抑制中性粒细胞和肥大细胞等炎性反应细胞流入受损器官[30-31]。CLR 是一种模式识别受体，可以识别不同且保守的外源性病原体相关以及内源性损伤相关分子模式，这些可以相互作用引发下游信号级联，导致产生炎症介质，进而产生炎症反应[32]。以上通路均为关键靶点显著富集的通路，与炎症反应、血管功能等关系密切，有效成分可能通过介导多条通路来发挥其药理作用治疗STP，体现出四妙丸多通路的协同作用机制。

本研究基于网络药理学方法探讨的是四妙丸治疗STP 的作用机制，吴越等[14]探讨的则是四妙丸治疗骨关节炎的作用机制，发现四妙丸主要通过槲皮素、汉黄芩素(Wogonin)、山柰酚(Kaempferol)、巴马汀(Palmatine)、黄连碱(Coptisine)、黄芩素(Baicalein)等有效成分作用于前列腺素G/H 合成酶2(PTGS2)，丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)，肿瘤坏死因子(TNF)，雄激素受体(A R)等靶点以及IL-17 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症的AGE-R AGE 信号通路、松弛素信号通路、TNF 信号通路、破骨细胞分化等通路来治疗骨关节炎。其中汉黄芩素、山柰酚、巴马汀、黄连碱、黄芩素等有效成分在治疗过程中多起到保护关节软骨，抑制炎性反应的作用，槲皮素作为四妙丸治疗两种疾病时发挥主要作用的有效成分，在治疗骨关节炎时其主要作用是通过抑制和减少活性氧种类(ROS)和下游因子(如MMP)来保护关节软骨，减轻关节软骨细胞外基质的降解来改善骨关节炎，而在治疗STP 时则多取其抗炎、抗氧化、修复血管内皮细胞的作用。在治疗骨关节炎时主要作用的靶点及通路多介导参与的是软骨的降解与损伤修复，炎性反应的调节过程，而治疗STP时主要作用的靶点及通路则更多参与介导的除炎性反应的调节过程以外，更多的是对血管功能的改善与保护。综上所述，四妙丸在治疗骨关节炎及STP 时发挥的相同作用是抑制炎性反应，不同的是治疗骨关节炎时要保护关节软骨，治疗STP时则要改善血管功能。

本研究说明了四妙丸中的多种成分可能通过作用于多个靶点和介导多项通路发挥抑制炎症反应、抗凝、保护血管内皮的作用，从而达到治疗STP 的效果。但考虑到网络数据库不够完善，所以存在一定的局限性，四妙丸治疗STP 的作用机制还需要进一步的实验研究及临床研究进行完善和验证。