基于网络药理学和分子对接探讨程氏萆薢分清饮治疗慢性前列腺炎的机制研究

张 晨，骆睿翔，赵 通，刘利红，息金波，廖晓星，赵盟杰，李海斌，刘 冬

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是成年男性最常见的泌尿生殖系统疾病，发病率高，持续时间超过3 个月，多以小腹、会阴、腰骶区等前列腺周围的疼痛或不适为主要表现[1]，伴有性功能障碍、精神神经症状的一类综合征[2-4]。据统计，国内报道CP 的发病率为6.0%～32.9%，高于国外[5]。目前CP 的发病机制尚未完全明确，西医主要采用抗生素或α 受体阻滞剂等药物治疗，疗效不佳[6]。中医学理论强调整体性与统一性，辩证与辨病相结合，疗效显著。近年来中医药被广泛应用于CP 的治疗中，其在提高尿流量、控制炎症反应及改善患者临床症状等方面具有独特的疗效[7-9]。

根据CP 的临床表现，可将其归属于中医“淋证”“遗精”“白浊”“阳痿”的范畴。湿热瘀结是本病的主要病因，气血瘀滞始终贯穿始末，病久终致脾肾虚衰[10]。本病病机特点是本虚标实，标实多见湿热、浊毒、血瘀、气滞、寒凝，本虚多为脾肾亏虚[11]。程氏萆薢分清饮出自清代医学大家程钟龄所撰《医学心悟》[12]，具有清热利湿、分清化浊的作用，是治疗赤白浊的主方。方中川萆薢苦平，利湿化浊分清；车前子甘寒，渗利膀胱湿热；黄柏苦寒，清热燥湿泻火坚阴；莲子心苦寒，清心凉血；丹参苦微寒，通心窍、清血热；白术、茯苓健脾燥湿；石菖蒲辛香苦温，交通心肾、化湿浊[13-14]。临床上萆薢分清饮治疗CP效果显著[15]，但目前关于萆薢分清饮治疗CP 的基础研究较少，相关作用机制及分子通路靶点尚不明确全面，从而限制了萆薢分清饮在临床上的应用。

网络药理学最早是由Hop-kins 提出的研究方法，该方法首先通过公共数据库及文献检索，结合生物信息学技术筛选出已知药物成分及特定疾病的靶点信息，然后利用网络可视化工具构建“活性成分-靶点-通路-疾病”网络模型，最后通过多层次分析找出活性成分与疾病相关联的关键节点，从而预测药物防治疾病的药理学机制[16]。因此，本研究旨在运用网络药理学的研究方法挖掘萆薢分清饮治疗CP 的潜在作用机制，为以后的基础研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分及相关靶点筛选 借助中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)（https://tcmspw.com/index.php）检索萆薢分清饮中8味中药的化学成分，根据ADME（absorption,distribution,metabolism,excretion）原则，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、类药性指数（drug-likeness,DL）≥0.18[17]为筛选指标，获取有效化学成分及相应蛋白靶标。通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库筛选出与人类相关的基因并进行整理,进一步获取相应靶标的基因信息及标准化名称。

1.2 “中药-有效成分-靶点”网络的构建 将整理出的药物有效化学成分与靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建“中药-活性成分-靶点”网络图。

1.3 慢性前列腺炎相关靶点的获取 借助人类基因数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/)和人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://www.omim.org/)筛选CP 的疾病靶点，以“chronic prostatitis”为关键词检索，合并检索数据并删除重复值后得到CP 疾病靶点信息。将药物有效成分作用靶点和CP 疾病靶点基因取交集，得到萆薢分清饮治疗CP 的关键靶点。

1.4 关键靶点蛋白PPI 网络的构建 STRING 数据库（https://string-db.org/）是一个用来分析已知蛋白质和预测蛋白质之间相互作用的数据库。将关键靶点导入STRING 数据库，选择物种为“homo sapiens”，将置信度设定为0.700，并将游离靶点进行隐藏，其他参数不变，构建关键靶点蛋白的蛋白互作关系(PPI)网络图。

1.5 萆薢分清饮与CP 关键靶点的富集分析Metascape 数据库(https://metascape.org/)是一个整合了GO、KEGG、Uniprot 等多个数据库的工具，可用于GO 分析和信号通路分析，并且具有时效性和准确性[18]。将关键靶点导入Metascape 数据库，对其进行基因本体论(gene ontology,GO)富集分析，包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component,CC)3 个部分；同时对其进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)富集分析，以预测萆薢分清饮治疗CP 的可能机制。

1.6 分子对接验证 从PDB 蛋白数据库（http://www.rcsb.org/）中下载核心靶点蛋白质结构，运用PyMol 2.4 软件除去水分子、杂链、分离原配体，保存后导入Autodock Tools 1.5.6 软件中加氢、计算总电荷，保存为“pdbqt”格式。从TCMSP 数据库下载活性化合物mol2 结构，运用Autodock Tools 软件设置可旋转键后保存为“pdbqt”格式，最后利用Autodock-vina 1.1.2 软件进行分子对接，PyMol 软件建立对接相互作用模式图。

2 结果

2.1 萆薢分清饮化学成分及靶点的获取 借助TCMSP 平台，并根据OB ≥30%及DL ≥0.18共筛选出萆薢分清饮有效成分150 种，其中萆薢2个、黄柏37 个、石菖蒲4 个、茯苓15 个、白术7 个、莲子心11 个、丹参65 个、车前子9 个；将活性成分逐一与潜在靶点配对，剔除无靶点活性成分，全方共122 个靶点：萆薢2 个、黄柏24 个、石菖蒲4 个、茯苓6 个、白术4 个、莲子心9 个、丹参65 个、车前子7 个。通过Uniprot 数据库将靶点名称导入，找出其与人类相关的基因并进行合并去重，最终获得200 个基因。

2.2 “中药-有效成分-靶点”网络的构建 将有效成分和靶点基因导入Cytoscape3.7.2 软件，从而得到萆薢分清饮的“中药-有效成分-靶点”相互作用的网络图，见图1。其中节点(node)表示中药、有效成分和靶点基因，边(edge)表示有效成分与靶点间的相互作用关系，设置网络中节点大小和颜色深浅反映Degree 值，该图共包含326 个节点、1 714 条边。结果表明，luteolin（木犀草素）、betasitosterol（β-谷甾醇）、tanshinoneiia（丹参酮IIA）、quercetin（槲皮素）、dihydrotanshinlactone（二氢丹参内酯）salviolone（鼠尾草酚酮）、miltirone（丹参新酮）、kaempferol（山奈酚）、diosgenin（薯蓣皂素）、dinatin（高车前素）等主要成分连接的靶点较多，因此这些成分可能为萆薢分清饮治疗CP的核心活性成分，见表1。

表1 萆薢分清饮核心成分

图1 “中药-有效成分-靶点”网络图

2.3 CP 相关靶点的获取 借助人类基因数据库(Gene Cards,https://www.genecards.org/)和人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://www.omim.org/)筛选CP 的疾病靶点，以“chronic prostatitis”为关键词检索，合并检索数据并删除重复值后，按score分数排序，在Excel 中运用“MEDIAN”算法计算中位数，并依据大于中位数的标准进行筛选，最终获得CP 相关靶点1 067 个。将疾病靶点与有效成分作用靶点取交集后最终获得117 个关键靶点基因，见图2。

图2 萆薢分清饮与CP 共同靶点韦恩图

2.4 萆薢分清饮与CP 关键靶点蛋白PPI 网络的构建 将117 个关键靶点基因导入STRING 平台，依据网络复杂程度，将置信度设置为0.700，隐藏游离靶点，生成PPI 网络，见图3。每条边代表蛋白与蛋白相互作用关系，其边数数量与相关蛋白核心程度呈正相关，共涉及117 个节点、1 124 条边，平均节点数为19.3，平均局部聚类系数为0.596。并将其TSV 格式数据导入Cytoscape3.7.2 进行可视化分析，绘制蛋白关系网络（图3）。该图包含115 个节点、2 274 条边，选取排名靠前的20 个靶点蛋白构建相互作用网络图及柱状图，见图4、5。左列为基因名，数字为相应基因邻接节点数目。因此，推测萆薢分清饮中的AKT1、TP53、IL6、MAPK8、MAPK1、VEGFA、TNF、JUN等为治疗CP 的核心关键基因，见表2。

表2 萆薢分清饮治疗CP 的核心靶点

图3 “萆薢分清饮-CP 相互作用蛋白PPI 网络

图4 “萆薢分清饮-CP”PPI 核心靶点前20 位PPI 网络图

2.5 基因本体论(gene ontology，GO) 富集分析 通过Metascape 数据库对117 个关键靶点进行GO 富集分析，包括BP、MF、CC 共3 个部分，见图6。筛选Metascape 平台排名前10 的富集结果，其中生物过程（BP）主要包括凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、对无机物质的反应（response to inorganic substance）、对有毒物质的反应（response to toxic substance）、对疼痛的反应（response to wounding）、细胞死亡的正向调节（positive regulation of cell death）、细胞对有机循环化合物的反应（cellular response to organic cyclic compound）、细胞迁移的正向调节（positive regulation of cell migration）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对含氧水平的反应（response to oxygen levels）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process），细胞组成（CC）主要包括膜筏（membrane raft）、细胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）、囊腔（vesicle lumen）、主轴（spindle）、黏着斑（focal adhesion）、细胞器外膜（organelle outer membrane）、RNA 聚合酶II 转录因子复合物（RNA polymerase II transcription factor complex）、谷氨酸能突触传递（glutamatergic synapse）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复 合 物（serine/threonine protein kinase complex）、细胞基部（basal part of cell），分子功能（MF）主要包括转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白激酶绑定（protein kinase binding）、蛋白质同二聚活动（protein homodimerization activity）、蛋白域特异性结合（protein domain specific binding）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、蛋白质异源二聚体活动（protein heterodimerization activity）、激酶调节活动（kinase regulator activity）、血红素结合（heme binding）、整合素结合（integrin binding）、核受体活动（nuclear receptor activity）。

图5 核心靶点前20 位柱状图

图6 GO 富集分析图

2.6 京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)富集分析 通过Metascape 数据库对共同靶点进行KEGG富集分析，共富集114 条信号通路。剔除不相关通路，筛选富集显著的前20 条通路以柱状图和气泡图的方式可视化，见图7、8。萆薢分清饮治疗CP 的主要通路有癌症相关通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路、细胞衰老、凋亡、细胞周期性代谢等通路。

图7 KEGG 富集分析“核心靶点-信号通路”图

图8 KEGG 富集分析通路气泡图

2.7 分子对接验证 利用Autodock-vina 1.1.2 软件对萆薢分清饮中核心成分与关键靶点进行分子对接，将核心化合物排名靠前的10 种化合物分别与关键靶点AKT1、TP53、IL6、MAPK8、MAPK1、VEGFA、TNF、JUN 对接，分子对接结果见表3。

表3 分子对接结果

一般认为配体与受体结合能越低，结合的构象越稳定，≤-4.25 kcal/mol 说明两者有一定的结合活性，≤-5.0 kcal/mol 说明两者有较好的结合活性，≤-7.0 kcal/mol说明两者有强的结合活性[19]。对接结果表明，萆薢分清饮中核心成分与关键靶点蛋白普遍具有较好的结合力，其中木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、薯蓣皂素（MOL000546）比原始配体的结合活性还强，表明这些成分与靶点有更佳的结合力，可能为萆薢分清饮治疗CP 发挥重要作用的关键药效成分。利用Pymol 软件将核心成分与MAPK8、IL6、TNF、AKT1 和TP53 靶点对接结合能较高的结果进行可视化处理，结果见图9。

图9 分子对接模型图

3 讨论

祖国医学将CP 归为“精浊”等范畴[20]，临床上以发病缓慢、反复发作为特点[21-22]。关于CP的发病机制至今尚未十分明确[23]。现代中医药方法采用辨病和辨证相结合的手段，发挥中西医学各自优势来提高疗效[24]，在辨病的同时强调辨证论治[25]。在CP 中医辨证中，湿热瘀滞证是最常见的证型[26]，治疗上以清热利湿，活血化瘀为主。程氏萆薢分清饮为治疗湿热瘀阻证常用处方，组成为黄柏、石菖蒲、川萆薢、茯苓、丹参、白术、莲子心、车前子，主治下焦湿热所引起的各种不适[27]。现代药理研究表明，萆薢中主要含有甾体类、二芳基庚烷类、木脂素类等化学成分，具有抗肿瘤、降尿酸、抗真菌等药理作用[28-29]，主要用于慢性前列腺炎、乳糜尿、湿性关节炎等病的治疗中[30]；石菖蒲中的有效化学成分α-细辛醚可减少炎性因子的表达[31]，β-细辛醚能够抑制多种炎性因子的形成[32]，且具有显著的利尿作用[33]；黄柏的主要成分生物碱具有抗肿瘤、抗炎[34]、抗菌[35]、镇静、镇痛等药理作用[36-37]，具有抗前列腺炎症渗透作用[38]，能够减少前列腺蛋白渗出量[39]；车前子有效成分中的乙醇提取物具有利尿作用,可增加水、电解质排泄[40]，其车前子提取物能够抑制良性前列腺增生[41]；茯苓的有效成分茯苓酸具有显著的利尿作用[42]，改善相关排尿症状。白术的有效成分白术内酯具有抗肿瘤、抗炎、抗血小板凝集、免疫调节等作用[43]；丹参活性成分丹参酮具有抗血小板聚集、改善炎症的作用[44]；现代药理学研究表明莲子心具有较强的抗炎作用[45]。因此，萆薢分清饮治疗CP 有客观的理论依据，本研究运用网络药理学方法对萆薢分清饮的有效成分和作用机制进行综合分析。

本研究共筛选出萆薢分清饮有效成分150 种，其中木犀草素、丹参酮 IIA、槲皮素、鼠尾草酚酮、β-谷甾醇、丹参新酮、二氢丹参内酯、山奈酚、薯蓣皂素、高车前素等主要成分连接的靶点较多。木犀草素通过抑制AR/NF-κB 信号[46-47]的活化，下调肿瘤坏死因子（TNF）-α 和白细胞介素（IL）-6 表达，减少炎性细胞浸润[48]；与抗氧化信号通路结合发挥强抗氧化活性。丹参酮 IIA 通过抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 等细胞因子的释放发挥抗炎作用，同时减少前列腺素（PGE2）的表达[49]。槲皮素通过抑制p38MAPK信号[50]通路调控炎症反应，缓解CP 的病情进展和疼痛。β-谷甾醇通过增加谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低过氧化氢酶活性[51]发挥抗氧化作用；减少NO 的合成，抑制巨噬细胞IL-6 活性,减少IL-1、TNF-α 等炎性因子的分泌[52]。山奈酚具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用[53-54]；通过调控MAPK 通路发挥抗炎和神经保护作用[55]。高车前素可减少血管内皮中炎性因子(IL-1β、IL-18、ICAM-1)的分泌[56]。因此，以上成分可能为萆薢分清饮治疗CP 的主要活性成分。

PPI 网络结果筛选出萆薢分清饮治疗CP 的8 个关键靶点为AKT1、TP53、IL-6、MAPK8、MAPK1、VEGFA、TNF、JUN。IL-6是人体内重要的抗炎性细胞因子，对机体内的抗感染与免疫反应意义重大[57-58]。有研究认为，自身免疫因素是CP 的病因之一，而炎性相关的细胞因子IL-6 在此过程中也发挥了重要作用[59-60]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是调控炎症反应的重要途经，与细胞增殖、分化、应激、炎症、凋亡、转化密切联系[61]。在CP 动物模型中，MAPK 信号通路参与了众多炎症因子的产生，尤其是IL-2、IL-6、TGF-β1 等作为MAPK 通路的下游表达因子与前列腺炎发病密切相关[62]。抑制MAPK 信号通路的过度激活，主要抑制ERK1/2、JNK 及P38 蛋白的磷酸化，可以降低大鼠机体的炎症反应水平[63]。有研究表明，在前列腺炎的患者中，会呈现较高血清水平的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）[64]。相关动物实验结果显示，抑制VEGFA 的表达可降低前列腺睾酮水平，起到抗纤维化和抑制平滑肌生长的作用[65]。TNF-α 由巨噬细胞分泌而来，是目前临床上公认的具有最强炎症效应及抗肿瘤作用的细胞因子[60,66]。转录因子（JUN）属于转录因子AP-1，通过抑制AP-1 的调节，往往伴随着炎性细胞因子和黏蛋白释放的抑制[67]。

本研究经富集分析发现，萆薢分清饮治疗CP可能与癌症相关通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1 信号通路、细胞衰老、凋亡、细胞周期性代谢等信号通路关系密切。癌症相关通路与多种信号通路紧密联系，其机制较为复杂，有待进一步探讨[68]。NF-кB 信号通路是目前炎症及免疫应答的最主要效应通路之一[69]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，激活后可直接作用于AKT，使AKT 发生磷酸化，进而激活NF-кB信号通路[70]。TNF可参与NF-κB通路导致NF-κB 活化；同时PI3K-Akt 信号通路激活亦可导致NF-кB 的活化[71-72]。HIF-1 可在一定条件下激活靶基因，使细胞发生增殖、凋亡、转移等一系列生物过程[73]。利用分子对接验证核心成分和靶点的结合活性，结果表明核心成分与靶点AKT1、TP53、IL6、MAPK8、MAPK1、VEGFA、TNF、JUN 的结合能均<-5 kcal/mol，表明它们具有较好的结合活性。

本研究从网络药理学和分子对接角度初步揭示萆薢分清饮治疗CP 涉及多靶点，多通路的作用机制，预测了萆薢分清饮治疗CP 潜在机制，为后续临床应用提供理论借鉴依据。