补体1q／肿瘤坏死因子相关蛋白9抑制心肌成纤维细胞的激活和迁移

李香敏，谭延振，张 冰，赵 荣，金振晓，易定华，孙 阳，易 蔚，张 平

心肌梗死后心力衰竭的发病过程中抗心肌纤维化研究探索一直是心血管领域研究的热点，但是尚未研究出确实有效的治疗靶点和方法。心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）在心肌梗死后慢性心力衰竭的发病机制中起着关键作用。补体1q／肿瘤坏死因子相关蛋白9（complement 1q／tumor necrosis factor related protein 9，CTRP9）作为一种分泌糖蛋白在心脏高度表达，在心血管疾病的保护中发挥重要的作用。转化生长因子β（transforming growth factor－β，TGF－β）家族是当前研究最多的纤维反应调节因子之一，控制多种细胞过程，它在心肌损伤后的适应不良和重塑中起着中心作用。蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）底物的磷酸化对细胞的代谢、分化、突触传递、离子通道活性、生长发育等多种功能至关重要。

本研究应用SD仔鼠原代CFs从细胞水平及蛋白分子水平研究介导CTRP9抗心肌纤维化作用及分子信号通路，从而研究出CTPR9通过PKA抑制CFs活性从而发挥抗心肌纤维化的作用及分子机理。

1 资料与方法

1.1材料 出生1～3天SD仔鼠由空军军医大学实验动物中心提供，实验条件严格按照国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》进行。抗－CD31抗体、抗－胶原蛋白（Collagen）Ⅰ抗体、抗－CollagenⅢ抗体、抗－波形蛋白抗体购于abcam公司，CellTiter 96©Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）购于Promega公司，细胞培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）低糖液体培养基购于HyClone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于gibco公司，H－89（dihydrochloride）购于MedChemExpress公司，磷酸－PKA C（Thr197）（D45D3）兔单克隆抗体、PKA RI－α（D54D9）兔单克隆抗体购于CST公司，rCTRP9由本实验室合成，Ⅱ型胶原酶购于Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1原代CFs分离培养及纯度鉴定 采用酶消化联合差速贴壁方法分离SD仔鼠左心室CFs。采用光镜观察及免疫荧光染色鉴定分离的CFs纯度。方法参考文章《原代SD仔鼠CFs分离培养方法改进》。CFs纯度可达95%以上，满足实验需要。

1.2.2CFs增殖检测 MTS法检测CFs相对数量。

1.2.3CFs向肌成纤维细胞转化实验 应用免疫荧光染色及Western Blotting检测CFsα－平滑肌肌动蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）表达变化评估CFs向肌成纤维细胞转化。

1.2.4细胞迁徙能力检测 应用细胞划痕实验及Transwell实验检测CFs迁徙能力变化。

1.2.5CFs纤维化相关蛋白表达变化检测 Western Blotting检测细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）表达水平变化，应用Image Lab 4．0．1软件对结果进行分析。

1.3统计学分析 文中和图中的所有数值均以n个独立实验的平均值±标准误（standard error of mean，SEM）表示。数据用Graph Pad Prism－5统计软件进行分析。对多组数据首先对所有实验组进行单向方差分析，然后进行Bonferroni's多重比较检验。P值≤0．05（双侧）认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1CTRP9通过PKA通路抑制TGF－β1诱导CFs

的增殖活性作用 应用MTS法检测CFs相对数量，TGF－β1可诱导CFs的增殖活性，CTRP9可抑制TGF－β1诱导的CFs增殖活性的作用，PKA抑制剂H－89可阻断CTRP9抑制TGF－β1诱导的CFs增殖活性的作用，且CTRP9＋H－89及H－89对CFs增殖活性无影响。见图1。

图1 CTRP9通过PKA通路抑制TGF－β1诱导CFs的增殖活性作用

2.2CTRP9通过PKA抑制TGF－β1诱导CFs向肌成纤维细胞转化 应用免疫荧光染色研究CFsα－SMA蛋白表达变化：无干预的Control组CFs表达很少的α－SMA蛋白，应用TGF－β1刺激诱导后，CFs大量表达α－SMA蛋白，细胞表型向肌成纤维细胞转变，应用rCTRP9处理后可抑制TGF－β1刺激诱导的α－SMA蛋白表达，而应用PKA抑制剂H－89后rCTRP9抑制TGF－β1诱导的α－SMA蛋白大量表达的作用减弱，rCTRP9联合H－89及单用H－89对CFs表达α－SMA蛋白基本无影响；应用Western Blotting研究得到相同结果：TGF－β1可诱导CFs表达α－SMA蛋白向肌成纤维细胞转化，CTRP9可抑制TGF－β1诱导的CFs表达α－SMA蛋白，抑制其向肌成纤维细胞转化，而PKA抑制剂H－89可阻断CTRP9抑制TGF－β1诱导CFs表达α－SMA蛋白的作用，且CTRP9＋H－89及H－89对CFs表达α－SMA蛋白无影响。见图2。

图2 TGF－β1诱导CFsα－SMA表达免疫荧光染色图像及Western Blotting图像及统计结果

2.3CTRP9通过PKA抑制TGF－β1诱导的CFs迁徙 应用细胞划痕实验和Transwell实验检测rCTRP9及PKA抑制剂H－89不同干预处理对TGFβ1诱导CFs迁徙影响：TGF－β1可刺激诱导CFs迁徙，CTRP9可抑制TGF－β1诱导的CFs迁徙，而PKA抑制剂H－89可阻断CTRP9的抑制TGF－β1诱导CFs迁徙的作用，且CTRP9＋H－89及H－89对CFs迁徙无影响。见图3。

图3 生长因子β1诱导的心肌成纤维细胞迁徙试验图像及统计结果

2.4CTRP9通过PKA抑制TGF－β1诱导CFs纤维化相关蛋白表达 应用Western Blotting检测rCTRP9及PKA抑制剂H－89不同干预处理对TGF－β1诱导CFs表达CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF三种纤维化相关蛋白影响：TGF－β1可诱导CFs CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF三种常用的纤维化相关蛋白表达水平增高，rCTRP9可抑制TGF－β1诱导的CFs CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF表达增多，而PKA抑制剂H－89可阻断CTRP9抑制TGF－β1诱导的CFs CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF表达增多的作用。见图4。

图4 不同干预处理对TGF－β1诱导CFs表达纤维化相关蛋白的影响Western Blotting图片及统计结果

3 讨 论

成纤维细胞是心肌纤维化过程中最直接的参与细胞，在心脏修复期，常驻的CFs群被激活［1－2］，通过合成α－SMA向肌成纤维细胞转化，并分泌大量结构细胞外基质蛋白［3－5］。心肌组织中TGF－β的表达在心肌梗死和心衰的动物实验模型中均显著增加［6－7］，以TGF－β信号通路作为抑制纤维化治疗的目标被长期探索［8－10］。本研究应用胶原酶消化联合差速贴壁的方法分离出原代SD仔鼠CFs作为细胞模型，应用在心肌损伤后的适应和重塑中起着重要作用的TGF－β1［6，11］，在细胞水平研究CTRP9抗纤维化的作用及分子机理。

心脏损伤后成纤维细胞的扩张和激活对心肌修复很重要，但也可能导致纤维化、重塑和功能障碍［5］。非梗死区成纤维细胞持续增殖激活是过度纤维化的发展一个重要方面，表达α－SMA是成纤维细胞激活的标志。TGF－β1可刺激诱导SD仔鼠CFs增殖激活。本团队研究发现应用CTRP9可明显降低TGF－β1诱导CFs的增殖活性，但未完全阻断CFs增殖活性。

TGF－β1可诱导CFs表达α－SMA，促使其向肌成纤维细胞转化。本团队进一步研究发现CTRP9可明显降低TGF－β1刺激诱导的SD仔鼠CFs表达α－SMA，应用PKA抑制剂H－89后CTRP9的这种作用消失；CTRP9激活的促生存信号分子PKA不仅从抗心肌细胞凋亡方面减轻心肌重塑［12］，还可以通过抑制CFs过度增殖激活参与抗心肌纤维化作用。

心肌梗死后CFs迁徙能力增强也是心肌纤维化的一个重要原因，本课题应用细胞划痕实验及Transwell实验研究发现应用刺激TGF－β1诱导的CFs迁徙能力增强可被CTRP9明显减弱，CTRP9的这种作用需要通过PKA通路，通过减弱CFs的迁徙能力，可减轻心肌梗死后成纤维细胞的过多聚集，发挥抗纤维化作用。

CollagenⅠ和Ⅲ是最常见的细胞外基质成分，它们分别占心脏细胞外基质胶原的85%～90%和5%～11%［13］。大多数心脏病都会导致细胞外基质中胶原沉积增加和重排，这些变化是组织修复和纤维化的一种形式［14－15］。在心脏损伤或TGF－β刺激后CTGF表达上调，分泌储存在细胞外基质中，作为一种基质细胞蛋白［16］，是一个纤维化效应因子［17－18］。本实验证实CTRP9对TGF－β1诱导的CFs分泌CollagenⅠ、Ⅲ及CTGF功能具有明显抑制作用，且这种抑制作用可被PKA抑制剂H－89阻断。

本研究发现CTRP9通过PKA通路可以降低TGF－β1诱导的CFs的增殖活性、向肌成纤维细胞转化及迁徙的作用，从而减低纤维化相关蛋白表达来发挥抗纤维化作用。对筛选心肌梗死后纤维化的治疗靶点具有很重要的意义。