添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛肠道菌群和短链脂肪酸含量的影响

何利娜，敖日格乐*，王纯洁，斯木吉德，阿日查，崔银雪，张 剑，刘 波，张 晨 (.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 0008；.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 0008)

酸马奶也称为马奶酒，是以新鲜的马奶为原料，经过传统发酵工艺而制成。酸马奶作为一种有营养的乳制品不仅口味独特而且还有很多对人体有益的作用，所以一直以来都受到人们的青睐[1]。乳酸杆菌、非乳糖发酵酵母菌、乳糖发酵酵母菌是酸马奶的主要微生物，研究表明，抗生素类物质可以在酵母菌生长代谢、繁殖过程中产生[2]。本试验所用乳酸杆菌菌悬液是采用蒙古族传统酸马奶发酵而成的，具有无污染、无毒、无残留、安全高效等特点，它不仅能够定植在动物肠道形成保护层，起到很好的屏障作用，从而阻止病原菌侵入，维持胃肠道菌群结构平衡，达到预防和治疗疾病的效果[3]。

新生犊牛具有以下特点：肠道发育不完全且微生物种类少，肠道内产生较少的内源性代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)[4]，因此其免疫力低容易感染发生疾病。有研究表明，幼龄动物肠道健康发育受肠道微生物和SCFAs的影响[5]。益生菌定居在肠道，通过各种方式抑制肠道致病菌。大多数益生菌通过发酵产生乳酸。通过增加产生短链脂肪酸的有益菌群，降低肠内的酸碱度，并且抑制对酸性环境敏感微生物的生长，从而降低肠道中病原微生物的含量[6]。然而，益生菌对肠道SCFAs含量的调节决定了这些功能的发挥[7]。在肠道中，有益菌如乳酸杆菌和双歧杆菌属通过发酵不可消化的糖，如膳食纤维、抗性淀粉和寡糖，以产生SCFAs[8]。反刍动物肠道如牦牛肠道中的拟杆菌科(Bacteroidaceae)和普雷沃氏菌科(Paraprevotellaceae)等菌群可通过在肠内代谢碳水化合物产生SCFAs[9]，小尾寒羊后肠段也富集大量能够产生SCFAs的菌群[10]。上述肠道菌群代谢产生SCFAs，为免疫细胞提供能量，促进黏蛋白的分泌，并防止病原菌在肠黏膜上的定植[11];其中丙酸和丁酸可增加抗菌肽的分泌并维持其黏膜屏障功能[12]。因此，SCFAs含量的变化已成为研究益生菌对肠道影响的重要指标[13]。

为此，本试验拟研究犊牛早期干预酸马奶源乳酸杆菌，是否对犊牛肠道菌群以及SCFAs含量有影响，假设通过添加酸马奶源乳酸杆菌可以增加肠道有益菌的丰度以及SCFAs的含量进而提高免疫力使其肠道健康发育，可为乳酸菌制剂在犊牛养殖的推广应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组本试验于2020年10月在山西河滩奶牛场进行，选择生长发育正常、体况及体质量相似(36±3) kg的3日龄内健康荷斯坦犊牛20头作为研究对象。随机分为4组，每组5头，分别为正常组、腹泻组、抗生素组和酸马奶组。除正常组外，其他3组均要建立腹泻模型。实验动物具体分组及饲养方案如表1所示。

表1 犊牛分组及饲养方案

1.2 主要试剂营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、MRS固体和液体培养基均购自广东环凯有限公司；SCFAs标准品，包括乙酸、丙酸和丁酸购自北京坛墨质检有限公司；2-乙基丁酸购自美国Sigma公司。

1.3 试验菌株及制备将内蒙古农业大学牛生产实验室从奶牛肠道中分离鉴定的致病性E.coliO1，于20%(V/V)甘油内-80℃保存，置于37℃水浴锅水浴融化，接种到固体营养琼脂培养基中37℃有氧培养24 h，挑单个菌落于营养肉汤中摇床37℃培养24 h，制成菌悬液，4℃保存备用。

酸马奶是从内蒙古自治区锡林郭勒盟阿巴嘎旗牧户家采集，试验所添加酸马奶源乳酸杆菌是从新鲜酸马奶样品中筛选出的乳酸杆菌，经鉴定为Lactobacillus.P。将20%(V/V)的甘油中-80℃保存的乳酸杆菌Lactobacillus.P置于37℃水浴融化，再分别划线接种到MRS固体培养基和营养琼脂培养基上，接种好的乳酸菌置于37℃厌氧培养24～48 h，选出单个菌落分别接种到MRS液体培养基和营养肉汤中，培养24 h。用酶标仪测定D600值来确定菌浓度，调整至试验所需浓度的菌悬液，4℃保存备用。

1.4 样品采集试验开始时，除正常组外，其他3组犊牛通过口服致病性E.coliO1菌悬液(2.5×1011CFU /mL,100 mL)来建立犊牛腹泻模型。观察犊牛腹泻症状，在建立腹泻模型3 d后，按照表1所示饲养方案进行饲养，饲养期15 d。在试验15 d采集每头牛的直肠粪样，置于离心管，放入液氮罐，带回实验室-80℃冷冻保存。

1.5 犊牛肠道菌群的测定将试验15 d采集的粪便样品于干冰保存送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司经16S rDNA V34区扩增测序。

1.6 犊牛肠道粪便SCFAs含量的测定样品前处理：取0.5 g粪样，置于10 mL离心管中，在离心管内加入8 mL酸稀释液(酸稀释液：15 mL 100 mmol/L 2-乙基丁酸和50 mL 5 mmol/L盐酸的混合液)，旋涡振荡仪上混匀3 min，使粪样与酸稀释液充分混合，制成粪便混悬液。在4℃ 15 000 r/min离心20 min，离心后取1 mL上清，经有机相0.22 μm 微孔过滤膜过滤后，置于进样瓶内待检。

标准品前处理：SCFAs的测定采用内标法，分别取标准品乙酸330 μL、丙酸400 μL、丁酸160 μL置于100 mL容量瓶内，将其混匀，用超纯水定容，制成混合标准储备液，再在离心管中分别加混合标准储备液0.200，0.150，0.100，0.050，0.025 mL，再于对应的离心管内加超纯水0.000，0.050，0.100，0.150，0.175 mL 配置成5个不同梯度的标准液，用2-乙基丁酸作为内标，取200 μL置于各浓度标准液中，混匀，用气-质联用仪进行分析。气-质联用仪测定SCFAs程序设计如表2所示。

仪器自动检测并分析样本数据，最后可得到相应的样本信息质谱图。将所得质谱图与标准数据库进行对比即可知道质谱图中各峰所代表的物质，根据绘制的标准曲线计算出各物质的含量。

表2 气-质联用仪测定SCFAs程序设计

2 结果

2.1 犊牛临床症状变化除正常组外，其他3组口服致病性E.coliO1菌悬液12 h后均陆续出现腹泻症状。粪便呈水样，由浅黄色逐渐变为灰白色，有恶臭味，并有眼球凹陷、食欲不振等现象。试验期间，与腹泻组相比，抗生素组腹泻情况有效改善。酸马奶组犊牛添加酸马奶源乳酸杆菌菌悬液后，不再出现腹泻症状。

2.2 添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛肠道菌群的影响

2.2.1序列分析 基于序列的97%相似性(identity)进行OTUs聚类，每组分别共得到：正常组340个、腹泻组276个、抗生素组254个、酸马奶组892个OTUs。其中每组特有的OTUs个数分别为正常组47个、腹泻组13个、抗生素组8个、酸马奶组567个(图1)。

NCC.正常组粪便；ECC.腹泻组粪便;CIPC.抗生素组粪便;MLPC.酸马奶组粪便

2.2.2添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物α多样性的影响 酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物α多样性的影响如表3所示。4组样品覆盖率为99.88%～99.92%。酸马奶组Sobs、Shannon、Ace 和Chao指数均显著高于正常组、腹泻组和抗生素组(P<0.05)，酸马奶组Simpson指数低于正常组、腹泻组和抗生素组，差异不显著(P>0.05)。微生物丰富度与Ace 和Chao指数成正比。微生物多样性与Shannon成正比，与Simpson指数成反比。说明酸马奶组犊牛直肠微生物丰富度与多样性显著高于其他3组(P<0.05)。结果表明，酸马奶源乳酸杆菌可以有效改善犊牛直肠微生物α多样性。

表3 犊牛直肠内容物α多样性指数分析 %

2.2.3添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物门水平的影响 酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物门水平的影响如表4所示。与正常组相比，腹泻组Firmicutes(厚壁菌门)的相对丰度显著降低(P<0.05)，酸马奶组显著提高(P<0.05)，抗生素组Firmicutes(厚壁菌门)的相对丰度增加，但差异不显著(P>0.05)。Fusobacteria(梭杆菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)的相对丰度，与正常组相比，腹泻组显著提高(P<0.05)，酸马奶组与抗生素组降低，差异不显著(P>0.05)。Proteobacteria(变形菌门)和Actinobacteria(放线菌门)的相对丰度4组间差异不显著(P>0.05)，但与正常组相比，腹泻组和抗生素组呈升高趋势，酸马奶组呈减少趋势。结果表明，酸马奶源乳酸杆菌干预后显著提高了Firmicutes(厚壁菌门)的丰度，降低了Bacteroidetes(拟杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Fusobacteria(梭杆菌门)和Actinobacteria(放线菌门)的相对丰度，说明添加酸马奶源乳酸杆菌可增加直肠内容物中有益菌的丰度，降低有害菌的丰度。

表4 犊牛直肠微生物门水平丰度 %

2.2.4添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物科水平的影响 酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物科水平的影响如表5所示。与正常组相比，酸马奶组Fusobacteriaceae(梭杆菌科)的相对丰度显著降低(P<0.05)，Prevotellaceae(普雷沃菌科)的相对丰度显著增加(P<0.05)。

表5 犊牛直肠微生物科水平丰度 %

2.2.5添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物属水平的影响 酸马奶源乳酸杆菌对犊牛直肠微生物属水平的影响如表6所示。与正常组相比，腹泻组Fusobacterium(梭杆菌属)的相对丰度显著升高(P<0.05)。与腹泻组相比，抗生素组和酸马奶组梭杆菌属的相对丰度显著降低(P<0.05)。酸马奶组unidentified_Lachnospiraceae和Alloprevotella(拟普雷沃菌属)的相对丰度显著高于其他3组(P<0.05)。

表6 犊牛直肠微生物属水平丰度 %

2.3 添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛粪便中SCFAs含量的影响由表7可知，与正常组相比，酸马奶组乙酸、丙酸和丁酸含量显著升高(P<0.05)，腹泻组乙酸含量显著降低(P<0.05)，丙酸和丁酸有减少趋势，但差异不显著。与酸马奶组相比，抗生素组乙酸、丙酸和丁酸含量显著降低(P<0.05)。说明添加酸马奶源乳酸杆菌可显著增加犊牛粪便中SCFAs含量。

表7 犊牛粪便中SCFAs含量 %

3 讨论

3.1 添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛肠道菌群的影响幼龄动物由于其免疫系统不发达[14]和缺乏免疫能力[15]，特别容易受到感染。越来越多的证据表明早期肠道微生物群的重要性，因为它在塑造宿主免疫系统中发挥重要作用[16]，并对成年以后的肠道健康产生长期影响[17]。据报道，在小鼠和人类婴幼儿时期，抗生素对早期微生物群的干扰会对宿主免疫功能带来长期负面影响，包括免疫缺陷或对病原体定植的敏感性增加[18-19]。研究表明，宿主营养物质消化代谢、免疫功能和机体健康等方面都与肠道菌群有紧密联系[20]，益生菌可以促进肠道发育和调节肠道菌群平衡[7]。据报道，用干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和其他益生菌治疗奶牛乳腺炎，发现益生菌可以使肠道菌群结构与功能发生改变，抑制病原菌的感染，减轻奶牛乳腺炎的症状[21]。本试验结果显示，酸马奶组犊牛肠道微生物丰富度与多样性显著高于其他3组。酸马奶源乳酸杆菌干预后显著提高了肠道内厚壁菌门、普雷沃菌科、毛螺菌科未确定菌属和拟普雷沃菌属的相对丰度，降低了拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门、放线菌门的相对丰度。说明添加酸马奶源乳酸杆菌后，犊牛肠道内有益菌增多，有害菌减少。

3.2 添加酸马奶源乳酸杆菌对犊牛粪便中SCFAs含量的影响SCFAs也称作挥发性脂肪酸，是由1～6个碳原子组成的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸及丁酸等。SCFAs可以让肠黏膜细胞增殖能力变强，维持肠上皮细胞完整性；SCFAs在肠道免疫中有重要作用，宿主抗菌肽的分泌可以通过丙酸和乙酸调节，达到抗菌效果；SCFAs还有抗炎作用和抗肿瘤的作用。有研究显示，SCFAs之所以能促进犊牛胃肠道健康发育，是由于SCFAs可以对犊牛肠道微生物的定植产生影响，其可以使肠道黏膜屏障保持完整并可以提高肠道的抗炎能力[22]，进而对犊牛的健康生长产生积极的影响。肠道中SCFAs的含量可以反映肠道细菌的活性，也显著影响肠道上皮细胞的代谢[23]。乙酸主要来自盲肠，被肠上皮吸收，然后进入门静脉，参与肌肉、脾脏、心脏和大脑的代谢。该途径是动物机体从小肠不能吸收的碳水化合物中获取能量的重要途径。丙酸不仅是肝脏代谢的能量来源，还能抑制胆固醇合成[24]。丁酸主要由厚壁菌门代谢产生，可以被结肠上皮细胞吸收和利用，也是结肠和盲肠的主要能量来源，对细胞分化和生长有重要作用，能抑制肠上皮细胞分泌肿瘤坏死因子[6]。丁酸盐是通过调节免疫系统[25]和维持肠上皮屏障[26]来维持肠道健康的主要SCFAs之一。因此，SCFAs能够调节肠道菌群平衡，改善肠道功能，肠道健康与体内SCFAs的含量密切相关。

据报道，饲喂从犊牛肠道分离的益生菌菌株减少了断奶前犊牛肠道中致病性大肠杆菌的定植。在出生后第1周给新生犊牛施用双歧杆菌和乳酸杆菌可以增加体质量及其饲料转化率，同时降低了腹泻发生率[27]。这些影响在断奶前的犊牛中比断奶后的犊牛更明显，这表明肠道建立微生物群落时，益生菌补充剂效果更佳，而当微生物群落稳定时，效果较差[28]。SCHNEIDER等[29]发现肠道疾病患者粪便中的丁酸含量低于健康人。将布拉氏酵母菌连续给药6 d，发现患者粪便中丁酸含量显著增加，总SCFAs含量也增加，可有效预防腹泻的发生。SAKATA等[30]在猪饲料中添加了4种益生菌，饲喂猪一段时间后，测定盲肠内容物中的SCFAs含量，结果表明SCFAs和乳酸含量显著增加。本研究结果显示给腹泻犊牛日粮中添加酸马奶源乳酸杆菌菌悬液可显著增加犊牛粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量。推测其原因是因为日粮中添加酸马奶源乳酸杆菌菌悬液促进了犊牛肠道中乳酸菌的增殖，导致肠道中乳酸含量增加，为丁酸产生菌提供了底物来源，从而促进了丁酸含量增加。而抗生素组中SCFAs浓度低于酸马奶组，其原因可能是抗生素抑制了肠道内产SCFAs菌和乳酸菌的增殖，从而使SCFAs含量降低。