CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用

马啸辰 综述 刘红玲 审校

哈尔滨医科大学第一附属医院眼科医院，哈尔滨 150001

基因编辑是近年来眼科实验研究的热点领域。眼球解剖结构独特，角膜透明，借助裂隙灯显微镜、光相干断层扫描等仪器，方便对眼部疾病进行观察[1]；另外，眼部缺乏淋巴管结构，眼球处于相对免疫赦免状态，对新抗原的免疫应答反应较弱，更适合外源性基因编辑治疗[2]。Ⅱ型CRISPR/Cas系统由前核糖体RNA、Cas9和反式激活CRISPR RNA(crRNA)组成，其中，Cas9经crRNA引导后与互补DNA靶序列结合，进而产生位点特异性DNA双链断裂，理论上可以在任何基因位点上实现DNA切割[3]。CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅在目的基因设计合成筛选上更为简便快捷，而且可以在单个细胞内同时靶向编辑多个基因位点，成倍地提高了基因编辑的效率，但Cas蛋白的不稳定性和脱靶效应在一定程度上限制了其应用[4]。基因编辑动物属于原发性疾病模型，其表型持续时间长，并可稳定遗传。对于已明确致病基因的疾病，构建基因编辑动物模型可真实地模拟疾病发生和演变过程。应用胚胎细胞克隆技术，还可批量制备基因型一致的动物模型，减少个体差异对实验结果的影响[5]。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进展进行综述。

1 角膜疾病

Schnyder角膜营养不良是一种罕见的常染色体显性遗传病，病因可能为染色体1P36位点的UBIA异戊二烯基转移酶结构域(UbiA prenyltransferase domain containing 1，UBIAD1)基因突变，角膜出现渐进性混浊，胆固醇和磷脂沉积，最终导致视力下降[6]。Dong等[7]采用CRISPR/Cas9技术构建Ubiad1(N100S)点突变小鼠模型，小鼠角膜可见点状沉积物；角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞中，线粒体形态结构异常，甘油磷脂代谢发生障碍。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)基因突变可导致角膜营养不良，其中TGF-β(R124C)突变与格子状角膜营养不良密切相关[8]。Kitamoto等[9]采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TGF-β(R124C)基因突变小鼠，40周龄时，约80%纯合TGF-β(R124C)基因突变小鼠和9.1%杂合小鼠出现角膜混浊，角膜基质层内有嗜酸性沉积，角膜出现大量TGF-β突变蛋白。以上研究有助于加深对角膜病发病机制的理解。

2 青光眼

Myocilin(MYOC)基因与青光眼密切相关[10]。Lynch等[11]采用CRISPR基因编辑技术构建Myoc基因突变大鼠模型，大鼠小梁网组织中可检测到MYOC突变蛋白表达，但大鼠眼压并未升高。Optineurin(OPTN) E50K基因突变可导致正常眼压性青光眼，其特点是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)进行性变性，最终可致盲[12]。Liu等[13]和Hou等[14]采用CRISPR/Cas9技术构建OptnE50K突变青光眼小鼠模型，蛋白组学分析显示自噬和线粒体功能相关的通路发生障碍；16月龄时，小鼠RGC轴突运输减慢；3月龄小鼠RGC轴突线粒体形态结构明显异常，且随年龄增长而加重；小鼠成年后出现视力损害和视网膜变性特征，但眼压正常。色素性青光眼以虹膜释放的色素沉积在前房为特点。黑素小体特异性蛋白(premelanosome protein，PMEL)参与黑色素合成、储存和运输，PMEL基因突变可导致色素性青光眼的发生[15]。Lahola-Chomiak等[15]采用CRISPR/Cas9技术构建pmel基因突变斑马鱼模型，斑马鱼眼部出现大量色素沉积。以上研究进一步扩充并验证了青光眼的致病基因数据库，为后续治疗研究提供了动物模型保障。

3 白内障

GJA8基因编码晶状体缝隙连接蛋白，该基因突变可引起先天性白内障[16]。Yuan等[17]将Cas9/sgRNA mRNA注射到兔受精卵中构建Gja8基因突变白内障家兔模型，结果表明约78.9%Gja8基因突变家兔具有小眼球和晶状体混浊表型。Mei等[18]采用CRISPR/Cas9技术构建pikfyve基因突变斑马鱼模型，斑马鱼晶状体中出现大量液泡样改变，晚期内体与该液泡共定位，晶状体纤维细胞明显肿胀，细胞核形态不规则。Karyopherin alpha 4(KPNA4)参与经典核转运过程，维持细胞内稳态[19]。Ping等[19]采用CRISPR/Cas9系统构建kpna4基因突变斑马鱼模型，在胚胎期可观察到晶状体混浊，晶状体上皮细胞层变薄，形态不规则。水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)是膜水通道的重要组成成分[20]。Tang等[21]采用CRISPR/Cas9技术构建Aqp5突变小鼠模型，6月龄时晶状体出现轻度混浊，9月龄时发生严重混浊。白内障的发病基因具有多样性，但针对特定基因位点构建基因编辑动物模型有助于筛选特定的发病基因，为后续的白内障基因回补治疗奠定基础。

4 眼底疾病

4.1 Leber先天性黑矇

KCNJ13基因表达于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞顶侧，其突变可导致Leber先天性黑矇[22]。Zhong等[23]采用CRISPR/Cas9技术构建Kcnj13突变小鼠，17周龄小鼠感光细胞几乎消失，视网膜结构严重受损。1%～2%的Leber先天性黑矇是由编码纤毛蛋白的LCA5基因突变引起的[24]。Qu等[25]采用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lca5基因，视网膜电图(electroretinography,ERG)检查示斑马鱼视觉异常；视杆和视锥细胞光感受器进行性变性，外节膜盘排列紊乱。

4.2 视网膜母细胞瘤

RB1等位基因失活可导致视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)发生。Naert等[26]采用CRISPR/Cas9技术改造非洲爪蟾RB基因，RB1或RBL1单一基因突变的非洲爪蟾并未出现RB，而RB1/RBL1等位基因突变蝌蚪迅速发展为RB表型；视网膜内出现大量嗜碱性肿块。

4.3 视网膜色素变性

Hexokinase Domain-Containing Protein 1(HKDC1)表达于视网膜光感受器内[27]。Zhang等[28]采用CRISPR/Cas9技术构建Hkdc1敲除小鼠模型，小鼠出现暗视ERG反应降低、外核层变薄、视紫红质蛋白异常定位和光感受器细胞凋亡增多等视网膜色素变性(retininitis pigmentosa,RP)病理特征。Chromosome 8 Open Reading Frame 37(C8ORF37)是常染色体隐性遗传RP的致病基因[29]。Sharif等[29]采用CRISPR/Cas9技术构建C8orf37基因突变小鼠模型，小鼠出现进行性视杆和视锥细胞退化，光感受器外节段膜盘大量解体。Parain等[30]采用CRISPR/Cas9技术对视紫红质基因进行改造，建立非洲爪蟾和热带爪蟾RP模型，爪蟾表现为视锥细胞形态异常并伴光感受器外节段萎缩和坏死。Domènech等[31]采用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠神经酰胺激酶样(ceramide kinase-like,CERKL)基因，小鼠视锥细胞数量减少、光感受器外节段形态异常和RPE细胞吞噬功能下降。进行性杆锥变性(progressive rodecone degeneration,PRCD)蛋白定位于光感受器外节段膜盘内[32]。Sechrest等[32]采用CRISPR/Cas9技术构建Prcd突变小鼠，小鼠光感受器外节段膜盘迂曲变形，视网膜中视紫红质表达水平显著下降。Zhou等[33]采用CRISPR/Cas9技术构建异天冬酰胺肽酶1(asparaginase like 1,Asrgl1)基因突变小鼠模型，9个月时小鼠视网膜外核层厚度开始减少；光感受器内、外节段变薄，视杆细胞和视锥细胞进行性变性。Koster等[34]采用CRISPR/Cas9技术构建卵磷脂视黄醇酰基转移酶(lecithin retinol acyltransferase,LRAT)基因突变大鼠模型，大鼠视网膜整体厚度变薄，ERG振荡电位降低。Yeo等[35]采用CRISPR技术构建Pde6b突变大鼠模型，3周时大鼠眼底可见色素沉着，视网膜光感受器出现变性，视网膜外核层厚度变薄。以上研究通过基因编辑技术模拟RP的发病过程，为RP治疗靶点的选择提供了依据。

5 眼部发育障碍

膜卷曲相关蛋白(membrane frizzled-related protein，MFRP)基因突变可导致眼球萎缩、上睑下垂、RPE细胞缺失和视盘玻璃疣等[36]。Collery等[36]采用CRISPR/Cas9系统在斑马鱼Mfrp基因中构建多个移码突变，斑马鱼视敏度降低、眼轴缩短和视网膜下巨噬细胞聚积。眼前段发育不全(anterior segment dysgenesis，ASD)常表现为角膜混浊、角膜Schwalbe线向前移位、虹膜发育不全、虹膜粘连和白内障[37]。Bonet-Fernndez等[38]采用CRISPR/Cas9技术构建cpamd8基因突变斑马鱼模型，该突变体斑马鱼出现严重ASD体征，其眼部病变包括虹膜角膜发育不全、眼球萎缩、前房浅和角膜基质胶原排列紊乱。哺乳动物Pax6基因定位于无眼基因座，其突变常导致眼部发育异常。Nakanishi等[39]采用CRISPR/Cas9技术改造水蚤的Pax6基因，部分存活幼体眼球形态异常，约8.2%第2代水蚤出现眼部异常。Yasue等[40]采用CRISPR/Cas9技术构建Pax6基因缺陷小鼠，胚胎期小鼠出现不同程度眼部发育异常。FREM2基因突变可导致胚胎皮肤水疱、隐眼、并指症和泌尿生殖系统畸形等[41]。Zhang等[42]采用CRISPR/Cas9技术构建Frem基因突变小鼠模型，小鼠出现双侧或单侧隐眼表型，伴眼球发育不良，还可并发角膜新生血管和虹膜粘连。

综上所述，CRISPR技术构建动物模型对于后续的基因编辑治疗具有重要意义，有助于扩充并验证疾病的致病基因数据库。目前，Mouse Knockout联合会等正在广泛使用该技术生成基因突变小鼠，以期探索疾病的发病机制[43]。但我们仍应注意到，动物疾病模型并不能完全模拟疾病的发生过程，可能会由于基因缺失而引发一系列代偿反应。完全性基因敲除往往会导致胚胎死亡，条件性基因敲除因可在某一特定的时间阶段或组织器官内调控靶基因的表达而越来越受到重视。此外，基因与其相应表型并非具有必然的对应关系，遗传背景及其他因素使基因编辑的结果更加复杂[44]。尽管如此，借助基因编辑技术构建疾病动物模型仍是一种非常有前景的探索疾病起源的方法，值得深入研究。

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