冬季不同海拔大绒鼠MC1R基因的表达量及UCP1、Hb、Mb含量的比较

韩春艳 贾婷 王炎 王政昆 朱万龙* 张浩*

（1 云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室，云南师范大学生命科学学院，昆明 650500）（2 云南经济管理学院，昆明 650106）

小型哺乳动物为适应环境变化需要调节形态和生理特征(Veloso and Bozinovic, 1993)，以此应对昼夜温差及季节变化带来的胁迫(Guanet al.,2018)。其中动物的毛色具有隐藏、交流和调节生理过程等功能，使其在伪装、繁殖、环境适应和疾病耐受性等方面具有竞争优势(Klungland and Vage,2000)。哺乳动物的毛色形成主要与体内黑色素细胞所产生的真黑素和棕黑素之间的化学转换有关(Coneet al., 1996)，前者又包括黑色和褐色两种色素类型(Fontanesiet al.,2011)。黑素皮质素受体1 (melanocortin 1 receptor,MC1R) 基因是调控黑色素合成的重要基因之一，它编码最小的G 蛋白耦合受体家族，影响黑色素形成的种类，进而影响动物的毛色，MC1R基因表达量越高，其动物毛色越黑(Jiaet al., 2021)。遗传物质和外界环境条件均影响动物毛色的形成(Macet al.,1996)。而哺乳动物毛色的深浅程度除了与色素颗粒的数量、大小、形状及排列方式有关外，也随海拔、温度、性别和年龄等因子而变化(张俊珍等，2006)。

不同地区分布的动物，除了毛色发生变化来适应环境，其生理指标的变化也是重要的适应对策，如动物的能量代谢受海拔的影响，在高海拔低温低氧条件下，动物体内褐色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT) 中的解偶联蛋白1 (uncoupling protein 1,UCP1)含量上升，UCP1 是分布在线粒体内膜上唯一能在褐色脂肪组织中表达的一类产热蛋白(Aquilaet al., 1985; Bouillaudet al., 1985)，使BAT 活化，脂质氧化分解增强，产热增加，维持体温，从而适应低温环境(Cunninghamet al.,1985)。动物在面对高海拔低温环境时，会增加UCP1含量促进产热(叶芳艳等，2016)。此外，动物的血红蛋白(hemoglobin，Hb)和肌红蛋白(myo‐globin，Mb)含量可以反映动物在高海拔低温低氧环境下血液指标的变化情况，一般高海拔地区动物的Hb 和Mb 含量高于低海拔地区(Vaibhavet al.,2021)。Hb 是红细胞的运输蛋白，对氧的结合、贮存、运输、释放具有重要的生理作用(Liet al.,2019; Nummelaet al., 2021)；Mb 是一种含血红素的氧结合蛋白，存在于心肌和其他肌肉组织中，具有储氧和输氧功能(Astrandet al.,2010)。Mb 对氧的亲和力是Hb 的6 倍(Ayeret al., 1971; Jay,2007)，是研究高原低氧适应生理机制的重要内容(Veloso and Bozinovic,1993)。在面临高海拔低温环境时，动物的Hb 和Mb 含量、浓度、pH 会发生变化(Christoforides and Hedley-Whyte, 1969)；研究表明人类和动物在高海拔缺氧条件下，Hb 和Mb含量会升高，但高原世居动物的Hb 和Mb 含量则不变，可能是由于长期处于高海拔地区，已形成一定的适应特性(李雪等，2019)。以上研究结果表明形态和生理指标都会随着海拔和温度的变化而发生变化，因此这些指标变化对于动物适应高海拔环境具有重要的意义。

横断山位于中国西南部，干湿季分明，立体气候显著(龚正达等， 2001)。横断山脉由于走向、地理位置的特殊性，使生存在此区域的生物逐渐进化出非常特殊的适应性，成为生理生态学研究的热点地区(王政昆等，2015)。大绒鼠(Eo‐thenomys miletus) 属于啮齿目(Rodentia) 仓鼠科(Cricetidae) 田鼠亚科(Microtinae) 绒鼠属(Eothe‐nomys)，是我国的特有种，广泛分布于横断山区及其附近区域(郑绍华，1993)，营地表浅层洞道生活，多在夜间活动，活动能力较弱，主要以草和鲜嫩的植物根部和茎部为食物(罗泽珣等，2000)。韩春艳等(2021)的研究表明在冬季分布于横断山不同海拔的大绒鼠体重和血清瘦素含量均随海拔升高而逐渐降低，但肝脏重量、下丘脑神经肽NPY 和AgRP 含量有升高趋势，说明不同海拔分布的大绒鼠在生理适应策略上已经表现出地区差异。但是大绒鼠为了适应横断山不同环境条件，其毛色变化和产热相关的生化指标变化还不清楚。因此为了研究不同海拔是否会引起大绒鼠毛色基因MC1R表达量及UCP1、Hb 和Mb 含量的变化，本研究在冬季于横断山区自北向南分别采集德钦、香格里拉、丽江、剑川和哀牢山5 个不同地区的大绒鼠，比较其毛色MC1R基因表达量及UCP1、Hb 和Mb 含量的地区差异，最终来阐明大绒鼠对横断山区不同海拔和温度的适应策略。

1 研究方法

1.1 实验动物

实验动物于2019 年冬季捕获，均为非繁殖期的健康成年个体。捕获地自北向南依次为：德钦、香格里拉、丽江、剑川和哀牢山(表1)。

表1 横断山区大绒鼠采样点Table 1 Features of the sampling site in E. miletus from Hengduan Mountain regions

1.2 实验动物处理

野外样本捕捉后，就地麻醉处死，对5个地区大绒鼠进行毛色拍照，采集大绒鼠血清、1 cm2的皮肤、分离肩胛间及颈部两侧的BAT，去掉白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)保存于冻存管中，用干冰保存送至云南师范大学生命科学学院动物生理生态学实验室，置于-80℃超低温冰箱内保存，用于后续的实验。

1.3 实验方法

1.3.1MC1R基因部分序列的分析

总RNA 的提取和纯化按照Lifetech 公司货号为15596026 的Trizol Reagent 试剂盒提供的方法进行。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度和完整性，RNA 于-80℃冰箱保存。cDNA 第一链的合成以总RNA 为模板，以天根生化有限公司货号为KR116 FastKing RT Kit (With gDNase)FastKing cDNA 第一链合成试剂盒进行逆转录扩增，按说明书加样后进行反应，反应完毕后，于-20℃冰箱保存。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 引物设计与扩增，根据大鼠MC1R基因序列的保守区域利用primer5.0 设计引物，由昆明硕阳科技有限公司合成。设计的引物长度为200 bp，前引物序列为MC1R-F：CTCCA CGGACTGCTTCCTAC，后引物序列为MC1R-R：GAGTGCAGGTTGCGGTTTTT。根 据Lifetech 公司的货号APPCR50PCR 清洁试剂盒，对先前反转录的RNA进行PCR扩增。

1.3.2MC1R基因在不同地区大绒鼠中的表达

1.3.2.1 荧光定量引物的设计

根据大鼠MC1R基因氨基酸序列的保守区域利用primer5.0 设计引物软件设计目的基因和内参基因引物序列，由昆明硕阳科技有限公司合成。设计的内参引物长度为250 bp，前引物序列为MC1R-F：GAAGGTCGGTGTGAACGGAT，后引物序列为MC1R-R：CCCATTTGATGTTAGCGGGAT。扩增后MC1R基因片段为约200 bp。

1.3.2.2 荧光定量检测基因的表达量

采用ABI-7000TM 实时荧光定量聚合酶链式反应仪(fluorescence quantitative polymerase chain re‐action，FQ-PCR) 扩增模板cDNA，并检测荧光信号。按SYBR Green realmastermix Mix 试剂盒说明配置FQ-PCR 反应体系，并进行测定，详见文献(Zhuet al.,2017)。

1.3.3 酶联免疫分析法(ELISA) 测定UCP1、Hb和Mb含量

采用和大绒鼠亲缘关系较近的小鼠ELISA试剂盒(上海沪宇公司) 测定相关指标。小鼠解偶联蛋白1 (UCP1) ELISA 试剂盒测定大绒鼠肩胛间BAT 中的UCP1 含量，其批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15%，检测范围：62.5~2 000 pg/mL，灵敏度：最低检测浓度小于10 pg/mL。用小鼠血红蛋白(Hb)ELISA试剂盒测定大绒鼠血清中血红蛋白含量，其批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15%，检测范围：10~320 g/L，灵敏度：最低检测浓度小于1.0 g/L。用小鼠肌红蛋白(Mb) ELISA 试剂盒测定大绒鼠血液中肌红蛋白含量，其批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15%，检测范围：1.5~48 ng/mL，灵敏度：最低检测浓度小于0.1 ng/mL。

1.4 统计方法

数据采用SPSS 22.0 软件进行分析，所有数据均符合正态分布。不同性别大绒鼠的测定指标差异不显著，故统计分析时合并使用。5 个地区大绒鼠的毛色基因MC1R的表达量及UCP1、Hb 和Mb 含量差异均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行分析，结果以平均值±标准误(mean±SE)表示，其中P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。FQ-PCR 的实验结果采用CT 值法(2-△△Ct法)进行分析，计算公式见(Zhu and Yang,2016)。

2 结果

2.1 MC1R基因的表达量和毛色变化

毛色基因MC1R扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，成功扩增出MC1R基因约200 bp。结果显示，MC1R基因表达量在不同地区的大绒鼠皮肤中具有显著差异(F4,24=5.158,P=0.049,图1)，其中哀牢山和剑川地区的大绒鼠MC1R基因表达量显著高于丽江、香格里拉和德钦地区，哀牢山和剑川MC1R基因表达量较其他3 个地区高262.71%。哀牢山和剑川地区的大绒鼠毛色相对于其他3 个地区较深，与MC1R基因表达量变化趋势一致(图2)。

图1 MC1R的相对表达量. 柱上不同字母表示组间差异显著(P<0.05)Fig. 1 Relative expression of MC1R. Different letters on the column indicate significant differences among different groups(P<0.05).ALS:AilaoMountain;JC:Jianchuan;LJ:Lijiang;XGLL:Shangri-la;DQ:Deqin

图2 五个地区大绒鼠的毛色对照图Fig.2 Comparison of coat color in E.miletus of five regions. ALS:Ailao Mountain;JC:Jianchuan;LJ:Lijiang;XGLL:Shangri-la;DQ:Deqin

2.2 UCP1、Hb和Mb含量

冬季5 个地区大绒鼠肩胛间BAT 中的UCP1含量差异极显著(F4,25= 4.785,P =0.005, 图3A)，德钦和香格里拉地区的UCP1 含量较哀牢山、剑川和丽江3 个地区高14.45%。冬季5 个地区大绒鼠Hb 含量差异不显著(F4,24= 1.123,P= 0.369, 图3B)，其中德钦地区的Hb 含量较哀牢山地区高40.53%。但是冬季5 个地区大绒鼠Mb 含量差异极显著(F4,24= 2.717,P= 0.042,图3C)，德钦和香格里拉地区的肌红蛋白含量显著高于哀牢山、剑川和丽江3个地区达17.65%。

图3 五个地区大绒鼠肩胛间BAT中的UCP1含量、血红蛋白含量、肌红蛋白含量变化. 柱上不同字母表示组间差异显著(P<0.05)Fig. 3 Variations of UCP1 of interscapular BAT,Hb and Mb contents in E.miletus from five regions. Different letters on the column indicate significant differences among different groups (P< 0.05). ALS:Ailao Mountain;JC:Jianchuan;LJ:Lijiang;XGLL:Shangri-la;DQ:Deqin

3 讨论

小型哺乳动物为适应不同环境条件，形态和生理特征会随着海拔、温度以及食物发生变化(Voltura and Wunder,1998)。如美洲兔(Lepusameri‐canus) 和北极狐(Vulpes lagopus) 等在严酷的、季节性很强的环境中进行换毛，由冬季的白色被毛变为夏季的棕色被毛，以此来更好地适应环境(Marketaet al., 2018)。韩春艳等(2021) 的研究表明冬季横断山不同地区的大绒鼠通过改变体重、器官重量、血清瘦素含量和下丘脑神经肽相对表达量，适应该地区不同的环境变化。MC1R基因不仅能改变毛色表型，还与动物行为等有关(封竣淇等，2017)。本研究结果表明MC1R基因在不同地区大绒鼠皮肤中的表达具有显著差异，其中哀牢山和剑川地区的大绒鼠MC1R基因表达量显著高于丽江、香格里拉和德钦地区。大绒鼠为适应哀牢山和剑川地区相对海拔较低、温度较高、植被丰富、土壤呈灰褐色的环境(刘醒华等，1981) 和躲避天敌，而加深毛色进行更好地隐藏；相对海拔较高的丽江、香格里拉和德钦地区植被稀疏，土壤呈红棕色(刘醒华等，1981)，因此这3 个地区大绒鼠MC1R基因的相对表达量较低。有研究表明动物在温度和湿度较高的环境条件下毛色较深(Jinet al., 2020)，且MC1R基因的差异表达会引起动物毛色的变化，如鸡、狗、狐狸、鼠等(Nowacka-Woszuket al., 2014)。黑色绵羊(Ovis aries)MC1R基因的表达量显著高于白色绵羊，原因可能是MC1R基因会激活色素合成过程中相关的限速酶酪氨酸酶相关蛋白(Tyrosinase-related Protein, TYR)基因，当TYR被激活时能够合成更多黑色素，从而使黑色绵羊产生深色的被毛(薛丽娜等，2021)。本研究2 个低海拔地区大绒鼠的毛色较深(图2)，MC1R基因表达量增加显著，与其他动物MC1R基因表达量的结果相符，说明大绒鼠的毛色和横断山不同地区的环境变化有关。

UCP1 是小型哺乳动物适应低温的重要生理特征(Golozoubovaet al., 2001)。研究表明冷驯化诱导BAT组织增生和UCP1表达上调，从而增强BAT产热活力以增加能量支出(Houet al.,2021)。本研究中冬季5 个地区大绒鼠的UCP1 含量差异极显著，德钦和香格里拉地区的UCP1 含量显著高于哀牢山、剑川和丽江，和冷驯化条件下大绒鼠UCP1含量上升结果一致(叶芳艳等，2016)，说明大绒鼠在低温条件下可通过增加UCP1 的含量来抵抗高海拔低温带来的胁迫，从而更好地适应不同海拔和温度的环境。Hb 是红细胞的组成部分，主要功能是在肺内进行氧气和二氧化碳的交换，将氧气和营养物质运送到全身各个组织(Storz and Jay,2007)。温度作为血红蛋白的一个重要变构因子，其微小变化即可引起血红蛋白分子结构、浓度、功能的显著改变(雷健明等，2012)。本文中，虽然不同海拔5 个地区大绒鼠Hb 含量差异不显著，但是高海拔低温地区的大绒鼠血红蛋白含量还是比低海拔地区的高，说明高海拔低温地区的大绒鼠为了适应低温，需要增加氧气的运输储存，从而增加代谢能力维持体温。Mb 是哺乳动物细胞储存和分配氧的蛋白质，是动物适应高海拔环境的重要生理指标(Maet al., 2014)。在本文中横断山不同海拔地区大绒鼠的Mb 差异显著，高海拔德钦和香格里拉地区的Mb 含量显著高于哀牢山、剑川和丽江地区，说明高海拔低氧地区大绒鼠为适应环境，而增加Mb 含量，有利于储存运输大量氧气，为其维持较高代谢率提供保证。此外，Mb 对氧的亲和力是Hb 的6 倍(Ayeret al., 1971)，所以相比Hb 含量，Mb 含量在不同海拔地区间反应更为明显。小型哺乳动物在面对高海拔低氧环境时表现出不同血液指标的适应策略，如高原鼢鼠(Eospa‐lax baileyi) 和甘肃鼢鼠(Eospalax cansus) 均表现Mb 和Hb 含量升高(魏登邦和魏莲，2001；潘巧琳等，2015)，和大绒鼠适应高海拔低氧环境的结果相符；但高原鼠兔(Ochotona curzniae)的Mb和Hb含量降低(王福宁等，2015)，通过比较这几种小型哺乳动物，发现不同地区的不同小型哺乳动物适应环境存在种属特异性。

综上所述，冬季5 个地区的大绒鼠通过改变MC1R的表达量来改变毛色以适应横断山不同的植被和土壤环境，通过改变UCP1、Mb 含量来增加产热能力以适应高海拔低温环境，最终通过整合形态和重要的生理指标来适应横断山冬季不同海拔的多样化环境。