桃金娘果多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

银慧慧，童艳梅，曾雪颜，卢光强，赵 武，姜源明，刘 伟

(1.广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001；2.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005；3.广西隆安县动物疫病预防控制中心，南宁 532799)

目前，抗生素的不规范使用以及抗生素残留和耐药性问题日趋严重，一些抗生素能够通过动物性食品转移到人体中，对人类的健康造成了严重威胁[1-2]。研究显示，从天然植物中分离的多糖具有广泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和抗糖尿病活性等，与抗生素作用性质相同，并且具有无污染、无残留、无致癌、无致突变和无致畸作用等优点，能够作为一种绿色新型的免疫增强剂，成为近代畜牧养殖道路上新的方向[3-5]。

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.)为桃金娘科桃金娘属常绿多花小灌木，是一种野生兼备食药功能的植物资源，果实中富含黄酮、多酚、多糖等多种活性成分[6-8]，中国南方地区民间常以其入药，用于急、慢性肠胃炎、痢疾以及提高人体免疫等，也有农民在日常饲料中添加桃金娘作为辅食提高家畜和家禽的免疫力。随着对多糖的不断深入研究，桃金娘多糖得到了越来越多的重视[9-10]，而桃金娘多糖提高机体免疫作用机制的相关研究鲜有报道。本研究利用免疫抑制小鼠模型对桃金娘果多糖的免疫调节作用进行评价，为桃金娘的保健及药用资源开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

桃金娘果(产地：广西玉林，经广西兽医研究所兽药新技术研究开发中心鉴定为桃金娘果实)；桃金娘果多糖，由广西壮族自治区兽药新技术开发中心实验室提供，为桃金娘的干果打粉经过水浴、醇沉(浓度为80%)、浓缩、过滤、干燥后获得，多糖的含量为65.8%。

1.2 主要试剂与仪器

环磷酰胺(CTX)购自上海源叶生物科技有限公司；小鼠白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)、过氧化物酶(POD)试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；溶菌酶(LZM)试剂盒购自上海联酶生物科技有限公司；生理盐水购自江西御医堂实业有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

TECAN Infinite M200酶标仪购自瑞士帝肯公司；分析天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-S4型恒温水浴锅购自江苏金怡仪器科技有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验动物和饲料

SPF级昆明小鼠96只，雌雄各半，体重为(20±2)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。试验期间动物房温度18～22 ℃，湿度50%～60%，小鼠自由摄食及饮水，适应性饲养4 d后进行正式试验。SPF饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 小鼠分组、造模及给药 对昆明小鼠进行腹腔注射环磷酰胺80 μg/g BW，1次/d，连续3 d，建立小鼠免疫抑制模型[9]。将造模成功的模型小鼠随机分为5组(每组16只)：模型组、黄芪多糖组、桃金娘果多糖低、中、高剂量组。 另设16只健康小鼠为正常组。 黄芪多糖组每只小鼠按200 μg/g BW剂量腹腔注射黄芪多糖混悬液，桃金娘果多糖低、中、高剂量组分别按50、100、200 μg/g BW剂量腹腔注射桃金娘果多糖混悬液，正常组和模型组每只小鼠腹腔注射等体积的生理盐水(0.02 mL/g BW)，1次/d，连续7 d。

1.4.2 小鼠脏器指数测定 于末次给药后禁食不禁水12 h，对所有小鼠进行称重。眼球采血，分离血清，置于-20 ℃保存待用；颈椎脱臼处死小鼠，取其胸腺、脾脏洗净、吸干后称量，并计算免疫器官指数：免疫器官指数=免疫器官重量/小鼠体重×100%。

1.4.3 小鼠血清细胞因子含量测定 于末次给药后禁食不禁水12 h，对所有小鼠进行称重。眼球采血，分离血清，根据ELISA试剂盒说明检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、LZM、POD的含量。

1.4.4 数据处理 采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和邓肯氏多重比较，结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 桃金娘果多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响

由表1可知，模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数明显偏低，均极显著或显著低于正常组(P<0.01；P<0.05)，提示模型组小鼠建模成功。与模型组相比，黄芪多糖组脾脏指数显著降低(P<0.05)，但胸腺指数无显著差异(P>0.05)；桃金娘果多糖不同剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均有不同程度提高，尤以桃金娘果中剂量组最高(P<0.01)。

表1 各组小鼠免疫器官指数(n=8)

2.2 桃金娘果多糖对免疫抑制小鼠血清细胞因子的影响

由表2可见，模型组小鼠血清中细胞因子IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-1β含量极显著或显著低于正常组(P<0.01；P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖组小鼠血清IL-6和IL-1β含量极显著或显著升高(P<0.01；P<0.05)；桃金娘果多糖不同剂量组血清IL-6、IL-1β含量相较于模型组均极显著升高(P<0.01)；黄芪多糖组和桃金娘果多糖低、中剂量组的血清IFN-γ、IL-2含量相较于模型组都有所提升，但差异均不显著(P>0.05)，桃金娘果多糖高剂量组的IFN-γ、IL-2含量极显著高于模型组(P<0.01)。

表2 各组小鼠细胞因子水平(n=6)

2.3 桃金娘果多糖对免疫抑制小鼠血清LZM含量和POD活性的影响

由表3可知，模型组POD活性和LZM含量均显著低于正常组(P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖组POD活性显著升高(P<0.05)，LZM含量有所升高，但差异不显著(P>0.05)。桃金娘果多糖低、中、高剂量组小鼠的POD活性和LZM含量均极显著或显著高于模型组(P<0.01；P<0.05)。

表3 各组小鼠POD活性和LZM含量(n=6)

3 讨 论

植物多糖具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗菌和抗癌活性等。与传统药物相比，生物活性植物多糖的副作用相对较少，因此受到越来越多的学者青睐[10-11]。从桃金娘果实中提取的桃金娘多糖，已被发现能够提高免疫功能，具有抗病毒和抗肿瘤等功效[12]。环磷酰胺是一种常用的治疗恶性肿瘤的代表性药物和免疫抑制剂，高剂量会引起免疫抑制作用和肠道溃疡[9]。基于桃金娘在免疫系统方面的积极作用，本研究通过建立环磷酰胺免疫抑制小鼠模型，分别从胸腺指数和脾脏指数、细胞因子水平变化等方面探讨了桃金娘果多糖的免疫功能作用。

胸腺和脾脏是机体的重要免疫器官，其重量的变化能够间接反映机体免疫水平的变化[13-14]。本研究结果显示，桃金娘果多糖不同剂量组均能显著提高小鼠胸腺指数和脾脏指数，说明桃金娘果多糖对免疫器官有一定的恢复和促进作用。

IL-1β是一种重要的促炎细胞因子，参与了机体中多种自身免疫性炎症反应和多种细胞活动[15]。有研究显示，黄芪多糖对大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β具有调节作用[16]。本研究表明，桃金娘果多糖不同剂量组均能极显著提高小鼠血清中IL-1β水平，发挥免疫调节作用。IL-2又称为T细胞生长因子，在免疫系统的治疗中起着核心作用[17]。 有报道指出人参茎叶多糖和海藻多糖分别对鸡和猪的IL-2分泌有调节作用[18-19]。本研究中，桃金娘果多糖高剂量能够极显著增高IL-2水平，由此可见，桃金娘果多糖能通过调节IL-2水平从而发挥调节机体免疫功能的作用。IL-6能够参与T细胞的早期激活，具有B细胞分化生物功能[20]。已有的研究表明，党参多糖可调节猪血清中IL-6水平[21]。本研究中免疫抑制小鼠经过腹腔注射不同剂量的桃金娘果多糖后，血清IL-6含量极显著增高，可能是随着桃金娘果多糖含量的增加，刺激了Th2细胞分泌增强所致。 IFN-γ是免疫反应的主要调节剂，在抗感染的保护性免疫中发挥重要作用[22]。研究发现，炙甘草多糖能明显促进T淋巴细胞分泌IFN-γ[23]。本研究结果显示，桃金娘果多糖能够提高免疫抑制小鼠血清IFN-γ水平，说明桃金娘果多糖可调节免疫抑制小鼠的免疫功能，提高机体的体液免疫和细胞免疫。Th1细胞主要产生的细胞因子有IL-2、TNF-β和IFN-γ；而Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13[24]。在正常情况下，机体中Th1/Th2细胞处于平衡状态，而当机体发生功能异常时，Th1/Th2出现平衡偏移，通过调节Th1或Th2细胞在机体中的水平，能够恢复机体正常功能。本试验结果显示，200 μg/g BW剂量的桃金娘果多糖能显著提高小鼠的血清IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-1β含量，提示桃金娘果多糖可能从调节Th1/Th2的平衡方面对机体的免疫功能起到调节作用。

过氧化物酶POD是一类氧化还原酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用[25]。溶菌酶LZM是一种糖苷水解酶，能够催化破坏某些细菌细胞壁[26]。有研究显示，山药块茎多糖和黄芪多糖分别对POD和LZM具有调节作用[27-28]。本研究结果显示，不同剂量的桃金娘果多糖均能够显著提高POD活性和LZM含量，改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

4 结 论

在本试验条件下，不同剂量的桃金娘果多糖对免疫抑制小鼠的胸腺、脾脏、以及血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-2、LZM含量和POD活性具有恢复和促进作用，其中桃金娘果多糖中剂量即100 μg/g BW对免疫抑制小鼠免疫功能恢复的效果最佳。这一结果为桃金娘果多糖作为免疫增强剂的深度开发和应用提供了一定的理论依据。