金银花、连翘及其药对对马链球菌马亚种耐药基因和毒力基因的影响

买占海，卢亚宾，李建龙,赵 璐，孙丹岚，佟盼盼，况 玲

(1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.昌吉州动物疾病预防控制中心，昌吉 831100)

马链球菌(Streptococcusequi，S.equi)属于β溶血链球菌，包括兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus，SEZ)、马亚种(Streptococcusequisubsp.equi，SEE)和类马亚种(Streptococcusequisubsp.ruminatorum，SER)3个不同的亚种[1]。马腺疫属于三类动物疫病，通常由SEE感染引起，是马属动物的急性接触性传染病[2]。带菌马已被认为是维持病原体长期存在和暴发感染的重要因素[3]，其发病率可达100%，死亡率达10%[4]。病原菌随病马咳嗽、脓肿破溃及喷嚏排出体外，经扁桃体、受损皮肤、上呼吸道黏膜或消化道感染健康马匹，患病幼年马也能将细菌传染给母马，可通过吮吸乳汁引发母马乳房炎或者败血症[5-6]。马链球菌的致病性与耐药性在国内研究较少，常见的毒力基因为fneB[7]，临床常用青霉素、四环素和磺胺类药物等进行治疗[8]，同时，耐药链球菌的出现也导致马场遭受很大经济损失，临床用药亟需新的思路。

金银花(LoniceraejaponicaeThunb.)作为传统中医药，具有散热、清火和解毒的功效[9]，可用于治疗喉痹、丹毒、热毒血痢、温病发热、痈肿疔疮和风热感冒等[10]，含有有机酸类、挥发油类、环烯醚萜类、黄酮类和三萜皂苷类等多种成分[11-14]。王清等[15]研究报道，金银花对金黄色葡萄菌、溶血性链球菌、肺炎杆菌、脑膜炎双球菌等多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌作用。 连翘(ForsythiasuspensaThunb.Vahl)具散热解毒、消肿散结的功能，可用于治疗发热、炎症、淋病、脓肿和丹毒，是广谱抗菌药，对多种革兰氏阳性菌有抑制作用。连翘属植物中的咖啡酰糖苷类成分也有很强的抗菌活性，其水煮液在体外有抑菌作用，可抑制链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌、痢疾杆菌和霍乱弧菌等，且未见耐药性形成[16-18]。在治疗马腺疫的大多数清热解毒方中均有金银花和连翘，如五味消毒饮、托里透脓散等，孔宪琴等[19]将五味消毒饮用于猪链球菌病的治疗，结果表明该方对链球菌有一定抑制作用。前期研究已经确定了所保存24株SSE菌的耐药基因和毒力基因[20]。根据中药金银花、连翘相须为用的特点，本试验通过金银花、连翘及其药对与SEE菌株共培养，探究其对SEE菌株耐药基因和毒力基因的影响，并接种至小鼠体内，观察金银花、连翘及其药对与SEE菌共培养能否有效地抑制SEE的耐药基因和毒力基因，为今后临床治疗马腺疫新药的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

携带fneB毒力基因的3株马链球菌马亚种菌株L1菌株(fneB基因)、D1菌株(lytA+fneB+ply基因)和Y1菌株(qnrA+blaTEM+fneB基因)均由新疆农业大学动物医学学院中兽医实验室分离鉴定并保存。192只SPF级健康昆明系小鼠，体重(20±3)g购自新疆医科大学实验动物中心(许可证号：SYXK(新)2018-0003)。

1.2 主要试剂及仪器

金银花、连翘均购自新疆乌鲁木齐市同济堂大药房；DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；2×TaqPCR Green Mix、ddH2O均购自天根生化科技(北京)有限公司；快速革兰氏染液购自新疆鼎枫生物科技有限公司；THB培养基购自青岛高科技工业医海博生物技术有限公司。

自动高压灭菌器(MODEL：HVE-50)、离心机(Eppendorf AG 22331 Hamburg)、TPro fessional PCR仪(Biometra)、DYY-6 C型电泳仪均购自北京市六一仪器厂；Bio-Rad凝胶成像系统(Universal Hood Ⅱ)、恒温水浴锅(DZKW-D-2)均购自北京市永光明医疗仪器有限公司；双人双面垂直洁净工作台(SW-CJ-2F)购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 中药制备 分别将10 g金银花、连翘原药研磨粉碎后，置500 mL圆底烧杯中。参考陈士林等[21]方法进行煎煮。金银花加12倍蒸馏水、连翘加入7倍蒸馏水，浸泡30 min后放置电热套上煎煮，220 ℃武火煮沸后调至120 ℃文火冷凝回流煎煮15 min；煎煮结束后放置离心机中4 000 r/min离心5 min去除药渣，用旋转蒸发仪浓缩即得到1 g/mL水提取物；金银花-连翘1∶1(各5 g)混合制成金银花-连翘药对组，将3份中药105 ℃高压蒸汽灭菌15 min，无菌分装备用。

1.3.2 SEE与中药共培养浓度的测定 在无菌状态下，吸取100 μL甘油保存的SEE菌株L1、D1和Y1菌株原液，加入100 mL THB培养液中，在恒温振荡器中37 ℃、160 r/min培养24 h后，在THB培养基上划线培养，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，挑取单个菌落于THB培养液中，在恒温震荡器中37 ℃、160 r/min培养24 h，测定其D600 nm值为0.6时备用。吸取经高压灭菌后的金银花、连翘、金银花-连翘1∶1的3组中药提取物按表1中的比例分别与3种SEE菌液混合，共分9组(L1+金银花、L1+连翘、L1+金银花-连翘1∶1、D1+金银花、D1+连翘、D1+金银花-连翘1∶1、Y1+金银花、Y1+连翘和Y1+金银花-连翘1∶1)在恒温振荡器中37 ℃、160 r/min培养12 h后，观察细菌菌落形态。待SEE与中药共培养后能够被检出为准。配比浓度梯度见表1。

表1 中药配比浓度梯度

1.3.3 SEE菌株形态检查 挑取与中药混合培养的3株SEE菌株的单菌落进行革兰氏染色，在油镜(1 000×)下观察其形态特征并拍照。

1.3.4 菌株耐药基因及毒力基因的PCR检测 本试验进行检测的耐药基因及毒力基因引物均参照文献[20]进行，耐药基因包括耐β-内酰胺类(blaTEM基因)和耐喹诺酮类(qnrA基因)2种；毒力基因包括ply和fneB2种，具体信息见表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反应体系20 μL：2×TaqPCR Green Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补至20 μL[22]。PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析系统观察结果，并于-20 ℃保存备用。

表2 引物信息

1.3.5 小鼠体内抑菌试验 试验设为空白对照组、中药阳性对照组(金银花水提取物、连翘水提取物和金银花-连翘1∶1配伍水提取物)、阴性对照组(SEE菌株Y1、L1、D1组)、试验组(Y1、L1、D1菌株分别与金银花、连翘和金银花-连翘1∶1共培养组：即Y1+金银花、Y1+连翘、Y1+金银花-连翘1∶1、L1+金银花、L1+连翘、L1+金银花-连翘1∶1、D1+金银花、D1+连翘、D1+金银花-连翘1∶1)。每组12只，雄雌各半。相同饲养条件下，断食不断水24 h后，各组小鼠分别腹腔注射对应药物或菌液，空白对照组小鼠注射灭菌生理盐水，各组剂量均为0.5 mL/只。接种后每隔4 h观察1次小鼠状态，连续观察7 d，统计各组小鼠存活率发现死亡小鼠后及时解剖，观察肝脏有无病理变化，并在无菌状态下采取肝脏组织，用于检测不同组fneB毒力基因。

1.3.6 小鼠体内SEE菌株的分离及fneB毒力基因检测 试验结束后处死剩余小鼠，无菌采集肝脏组织涂抹于THB培养基上，倒置于37 ℃的恒温培养箱培养24 h，挑取单菌落于THB培养液中进行增菌培养，并通过PCR和1.0%琼脂糖凝胶电泳分析小鼠体内分离菌，检测其fneB毒力基因的变化，方法同1.3.4。

2 结 果

2.1 药菌浓度配比结果

金银花、连翘、金银花-连翘1∶1与SEE菌株混合培养12 h后，接种于THB琼脂培养基中检测细菌存活情况。通过观察共培养细菌存活量发现，以细菌D600 nm值达到0.6时的培养条件为最适培养条件，最终确定适配浓度比例为：中药∶THB培养基∶待测菌液=1000∶500∶20。

2.2 SEE形态学观察结果

与金银花、连翘、金连1∶1共培养的3株SEE菌株在THB固体培养基中均能够正常生长且形态颜色未出现明显变化(图1A)。 革兰氏染色显示Y1+金银花-连翘1∶1呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，直径为0.6～1.0 μm，菌体似矛头状排列单个或多个排列成链状，无芽孢，无菌毛，与正常SEE相比无明显变化(图1B)。

A，与中药共培养的Y1链球菌落形态；B，Y1链球菌革兰氏染色镜检结果(1 000×)

2.3 耐药基因及毒力基因检测结果

2.3.1 耐药基因qnrA和blaTEM检测结果 Y1菌株与金银花、连翘、金银花-连翘1∶1共培养后，PCR未检测到qnrA和blaTEM耐药基因目的条带(图2)。

①A，qnrA基因；B，blaTEM基因。②M，DL2000 DNA Marker；1、15，D1菌株；2、3、10、11，Y1+金银花；4、5、12、13，Y1+连翘；6、14，Y1+金银花-连翘1∶1；7～9，Y1菌

2.3.2 毒力基因fneB和ply检测结果 3株SEE菌与连翘共培养后，PCR均未检测到fneB毒力基因(图3A)。 D1菌株与金银花、连翘、金银花-连翘1∶1 共培养后，PCR未检测出ply毒力基因(图3B)。

M，DL2000 DNA Marker；1，L1+连翘；2、8，D1+连翘；3、6，D1菌株；4、10，阴性对照；5，Y1+连翘；7，D1+金银花；9，D1+金银花-连翘1∶1

2.4 小鼠致病性试验结果

空白对照组和中药阳性对照组小鼠的存活率均为100%，阴性对照组(SEE菌株原液)Y1、D1和L1的小鼠存活率分别为16.7%(2/12)、8.3%(1/12)和0(0/12)，注射Y1+金银花、Y1+连翘、Y1+金银花-连翘1∶1的小鼠存活率分别为50.0%(6/12)、58.3%(7/12)、41.7%(5/12)；注射D1+金银花、D1+连翘、D1+金银花-连翘1∶1的小鼠存活率分别为58.3%(7/12)、66.7%(8/12)、16.7%(2/12)；注射L1+金银花、L1+连翘、L1+金银花-连翘1∶1的小鼠存活率分别为75.0%(9/12)、83.0%(10/12)、50.0%(6/12)(表3)。

表3 不同中药与3株SEE菌共培养接种小鼠死亡率

2.5 小鼠肝脏病理变化

解剖死亡的小鼠,将其肝脏与金银花组、连翘组、金银花-连翘1∶1组及空白对照组小鼠的肝脏进行对比，可以明显看出死亡小鼠肝脏出现肿大淤血、边缘钝圆，呈深红色，其余组小鼠肝脏均无明显变化。

2.6 小鼠fneB毒力基因检测结果

检测3株与金银花、连翘、金银花-连翘1∶1共培养SEE菌株注射小鼠后其fneB毒力基因表达情况，结果有8株携带fneB基因，分别为Y1+金银花、Y1+连翘、Y1+金银花-连翘1∶1、L1+金银花、L1+金银花-连翘1∶1、D1+金银花、D1+连翘、D1+金银花-连翘组，而L1+连翘组未检出fneB基因(图4)。

M，DL2000 DNA Marker；1，Y1+金银花；2，Y1+连翘；3，Y1+金银花-连翘1∶1；4，L1+金银花；5，L1+金银花-连翘1∶1；6，D1+金银花；7，D1+连翘；8，D1+金银花-连翘；9，L1+连翘

3 讨 论

中草药抗菌已经逐渐被人们熟知，金银花、连翘、黄连、黄芪、板蓝根、蒲公英、苦参等均具有抗菌作用[23]。本试验选取广泛应用于各类方剂中具有清热解毒、消肿散结的中药金银花和连翘，且金银花、连翘作为相须为用的药对具有较强的抑菌效果，故作为本试验的研究对象。而SEE菌株作为引起马腺疫的强毒株，在本试验中选取3株携带fneB毒力基因的SEE菌株作为试验菌株，主要探究其与金银花、连翘共培养后对小鼠的致病性与SEE原菌株对小鼠致病性的差异，并初步探究金银花和连翘水提取物的抑菌作用在基因层面上对SEE菌株的影响。

在进行耐药基因和毒力基因的检测中，中药共培养待测菌株中耐药基因qnrA、blaTEM和毒力基因fneB和ply毒力基因均未被检出，表明金银花、连翘可在基因层面影响细菌的耐药性和致病性。陶飞[24]研究表明，双花连翘提取物、黄芩苷、硫酸黄连素和天蚕素提取物与肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肠道沙门氏菌共培养，能够抑制细菌的生长，且在一定的时间内共培养对肺炎克雷伯菌的acc(3)-Ⅱ耐药基因、粪肠球菌的erm(B)耐药基因以及肠道沙门氏菌的SUL1耐药基因有影响，这与本试验结果一致。陈俭清等[25]认为，猪链球菌耐药性与生物被膜的形成有关，而连翘等中药对其生物被膜的形成有抑制作用，本试验探究的耐药基因可能与控制菌体生物被膜的形成有关，结果与陈俭清等研究结果一致。本试验在现有的条件下，实现了体外中药与细菌共培养，初步在基因层面探究了中药的抑菌作用对细菌致病力的影响。

通过不同中药与3株SEE菌株共培养并接种小鼠，试验结果表明3株菌均有一定的致病性。与连翘水提取物共培养的SEE菌株注射的小鼠成活率比原菌株阴性组高，表明连翘与SEE菌株共培养后其毒性明显降低，从而提高了小鼠的存活率；与金银花水提取物共培养的SEE注射的小鼠成活率均高于注射原SEE菌株小鼠，表明3株SEE菌株的毒性明显下降，但比连翘SEE菌株共培养组成活率要略低；金银花-连翘1∶1药对与原SEE菌株共培养菌注射的小鼠成活率略高于原SEE菌株组。体内抑菌结果表明，连翘水提取物的抑菌效果最好，明显降低细菌毒性，金银花水提取物次之，而金银花-连翘药对1∶1水提取物效果较差但也具有一定作用，接种原菌液的小鼠(阴性对照组)的存活率明显低于接种与中药水提取物共培养菌液的小鼠的存活率。说明中草药金银花、连翘与SEE菌共培养能够有效减弱SEE菌的毒性，同时表明SEE菌也存在致病性，该结果与王嵩[25]报道结果一致，揭示了中药抑菌作用的复杂性。魏振装[26]表明中药能够有效增强或调整细胞免疫和体液免疫，在体外对耐药菌有较强的抑菌作用，而且在体内通过提高机体的免疫力，具有抗病原微生物或直接或间接地灭活细菌内毒素，或能加速毒素的代谢等作用。

本研究对小鼠进行无菌解剖，从肝脏的病理变化可以明显看到除了接种原SEE菌株的小鼠肝脏肿大淤血、边缘钝圆以外其余各组均正常。肝脏的损伤程度证明了与金银花、连翘水提取物共培养后的SEE菌株的毒力明显降低，而连翘水提取物组与正常小鼠肝脏几乎无差别，说明连翘水提取物组对SEE菌株抑制效果最好。在王雨朦等[7]进行的相同研究中，小鼠肝脏仅发生非特异性炎症反应，病理切片中未出现典型病变，而本试验中小鼠肝脏病理变化与之相同。

小鼠体内分离菌株的耐药及毒力基因检测结果显示，与金银花、连翘及金银花-连翘药对水提取物共培养的待检菌株(共9株)中除去L1+连翘组感染鼠之外，其余8组均检出fneB毒力基因。小鼠体内分离菌株fneB毒力基因的检测结果表明，在小鼠体内分离的SEE菌株能够重新获得fneB毒力基因，出现菌种反毒复壮的现象，其机制有待进一步研究。小鼠致病性试验结果显示，虽然从小鼠体内分离的SEE菌株的fneB毒力基因得以表达，但接种与连翘水提取物共培养SEE菌株的小鼠仍然有很高的存活率，表明中药水提取物抑制细菌致病性不仅是通过抑制其毒力基因表达的方式进行，比如抑制其蛋白表达，从而阻止其进行生物膜合成，还有可能是通过抑制其他毒力基因的表达来提高小鼠的存活率[28-29]。

4 结 论

本试验研究结果表明，金银花、连翘及其药对不会影响SEE菌株的形态，但能够减弱SEE菌株的fneB、ply毒力基因和qnrA、blaTEM耐药基因的表达，连翘水提物的抑菌效果要优于金银花水提物。SEE菌株在小鼠体内具有重新恢复携带fneB毒力基因的能力。