加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制*

刘令令，段飞，杜巧婷，崔晨辉

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋线弯曲，定植于胃黏膜上皮细胞的一种需氧的革兰阴性杆菌[1]，被世界卫生组织列为第一类致癌因子[2]。幽门螺杆菌在全世界各地感染率高达50%[3]，传播方式多样且传染力强[4]。幽门螺杆菌感染与多种消化系统疾病的发生关系密切，如幽门螺杆菌阳性可导致消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌等[5-6]。因此，幽门螺杆菌感染是影响消化系统健康状况的主要诱因。慢性胃炎是由各种病因引起的胃黏膜慢性炎症，其中由幽门螺杆菌感染引起的慢性胃炎称为幽门螺杆菌相关性胃炎，幽门螺杆菌的感染是该病发生的主要诱因[7]。目前，临床上幽门螺杆菌相关性胃炎的治疗主要采用抗生素，疗效确切，但是依赖抗生素会使得病菌耐药性增强，用药疗效下降[8]。

中医药治疗幽门螺杆菌感染有独特的优势[9]。幽门螺杆菌感染相关性胃炎属中医“胃脘痛”“痞满”范畴[10]。其是由脾胃损伤，脾气虚，脾不健运，湿阻中焦，脾失升清，胃失和降，湿邪郁久化生为热所致，病机主要为虚实相存、寒热错杂、升降失调，致心下痞满、呕吐、脘痛、反酸等[11]。因此，中医治疗应以调畅气机、平寒调热、清热和胃、降逆止呕、消痞散结为主要治则[12]。有研究报道，加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎作用显著[13]。

中药具有多成分、多靶点、多途径的复杂作用特征[14]。这种复杂性使得中药药效物质基础不明确、作用机制不清楚，在临床用药以及在新药的开发方面带来了许多的局限性。而网络药理学是基于系统生物学的理论，从整体的角度探究药物与疾病之间的关联，在一定程度上解决了单靶点机制通路难以解释中药多成分、多靶点协同作用的问题，使中药药物研发具有可预测性[15]，为中医从经验医学转化为循证医学提供新的范例[16]。因此，本研究根据世界中医药学会联合会发布的《网络药理学评价方法指南》[17]，采用网络药理学方法对加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用进行分析，预测其潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件运用的数据库和软件详见表1。

表1 运用的数据库和软件

1.2 加减半夏泻心汤化合物与靶标获取运用中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)获取中药相应的化合物。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug likeness，DL)≥0.18，半衰期(half-life，HL)≥4 h为条件进行化合物筛选。并运用TCMSP查找筛选所得化合物对应的靶标信息，将所得靶标信息中的PubChem CId搜索到Canonical SMILES，之后进入Swiss Target Prediction将靶点的“相关靶点(Related targets)”统一转化成基因名。

1.3 幽门螺杆菌相关性胃炎基因获取以“Helicobacter Pylori-Associated Gastritis”为关键词从Gene Cards数据库和疾病-基因组合DisGeNET 数据库，搜索已发表过的与幽门螺杆菌相关性胃炎有关的基因，删除重复基因和假阳性基因，与加减半夏泻心汤中药复方药物基因进行匹配，搜集两数据的交集。

1.4 构建“疾病-中药-化合物-交集靶标(基因)”网络将中药复方药物有效成分、有效成分所对应的靶点以及幽门螺杆菌相关性胃炎疾病对应的靶点输入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图。在网络图中，节点(node)代表药物以及其有效活性成分、疾病、靶点等；边(edge)分别代表药物与活性成分、活性成分与活性成分作用靶点、疾病与活性成分作用靶点等之间的相互关系；节点的度值(degree)代表网络中节点与节点相连的数目，度值越大，越有可能成为化合物的关键作用靶点。

1.5 蛋白互作网络(protein interaction，PPI)构建将加减半夏泻心汤-幽门螺杆菌相关性胃炎共同作用靶点的基因导入STRING数据库，获取蛋白相互作用关系，分值越高说明蛋白相互作用置信度越高，数据可靠性越高，因此设置分值>0.9，筛选高置信度数据，将结果以TSV格式导出。将所得数据导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化，绘制PPI图。

1.6 GO富集以及KEGG通路富集分析将关键靶点基因输入DAVID数据库功能注释工具中Version 6.8，对加减半夏泻心汤作用靶点进行GO富集分析选择生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组成(cellular component，CC)3个模块以及KEGG通路分析，设定P<0.05以确定关键靶点富集通路。采用GraphPad Prism 8.0软件将图富集结果绘制BP、MF、CC富集分析图。借助微生信数据分析和可视化在线平台进行数据可视化处理，制成KEGG富集分析图，以阐释加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的生物功能及相关信号通路。

1.7 分子对接选取“有效成分-靶点”拓扑分析所得度值较高的前10种成分，在 TCMSP数据库中下载其3D结构，保存pbd格式。在拓扑性质排名靠前的靶蛋白中挑选4个靶蛋白基因，并从PDB数据库中下载核心靶点蛋白质结构，保存pbd格式，利用Autodock Tools 1.5.6软件删除水分子、加氢及加电荷，保存为pdbqt格式，同样利用Autodock Tools 1.5.6软件进行分子对接。将靶蛋白中的原配体抽离后与靶点对接，最后用PyMol 2.4软件实现对接结果可视化，建立对接相互作用模式图。

2 结果

2.1 加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎主要成分分析检索TCMSP，输入“半夏、黄连、黄芩、黄柏、大黄、延胡索、干姜、人参、甘草、大枣”，得到1 367个活性成分及相关信息，再以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h作为筛选条件，最终筛选出255个活性成分，见表2。

表2 加减半夏泻心汤药物活性成分

2.2 加减半夏泻心汤-幽门螺杆菌相关性胃炎共同靶点的筛选在Gene Cards 数据库中以“Helicobacter Pylori-Associated Gastritis”为关键词进行搜索，发现871个潜在作用靶点的基因。在韦恩图在线绘制平台中分别录入加减半夏泻心汤药物成分的344个靶点对应的基因与幽门螺杆菌相关性胃炎的871个基因，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点94个，见图1。

图1 加减半夏泻心汤与幽门螺杆菌相关性胃炎交集靶点韦恩图

2.3 构建“药物-成分-疾病-靶点”网络使用Cytoscape 3.7.2软件构建加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎作用靶点网络图，见图2。其中共有322个节点，103 362条边，每条边代表活性成分与治疗幽门螺杆菌相关性胃炎靶点的相互作用。绿色表示幽门螺杆菌相关性胃炎，蓝色表示药物，橘色表示加减半夏泻心汤药物所含活性成分，紫色表示这些活性成分对应的治疗幽门螺杆菌相关性胃炎作用的相关靶点。并根据Degree值进行分析，度值越高，说明其在网络中越重要。结果显示，槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、豆甾醇(Stigmasterol)、黄芩素(baicalein)在网络中排名较高，可认为是加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的主要活性成分。

图2 加减半夏泻心汤与幽门螺杆菌相关性胃炎的“药物-成分-疾病-靶点”网络

2.4 构建PPI将加减半夏泻心汤药物成分对应的靶点基因与疾病对应的靶点基因所得的交集基因输入STRING数据分析平台，进行蛋白互相作用分析后，下载其关系表格后，根据关联分数(combined score)≥0.9进行筛选，再运用Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI，见图3。网络图中包含 77个节点，图中圆形节点代表一个基因蛋白，边代表连接着的两个蛋白有相互作用关系。然后按照度值的多少，得到互作关系排名前4的蛋白为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、JUN、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinases 1，MAPK1)、MAPK14，见表3。

表3 加减半夏泻心汤与幽门螺杆菌相关性胃炎的关键靶点及其拓扑性质

图3 蛋白-蛋白相互作用网络

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析把得到的47个共同靶点导入DAVID数据库进行GO生物功能注释，获得GO条目482个(P<0.05)，分别包括生物过程(BP)383个，分子功能(MF)59个，细胞组成(CC)40个；其中生物过程包括对药物反应(response to drug)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、基因表达的正向调节(positive regulation of gene expression)、炎症反应(inflammatory response)等，分子功能主要包括蛋白质结合(protein binding)、丝氨酸型内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等，细胞组成主要包含细胞外液(extracellular space)、线粒体(mitochondrion)、基底外侧质膜(basolateral plasma membrane)、核质(nucleoplasm)等。根据Count值选取各自排名前10的条目绘制条形图，见图4。

图4 加减半夏泻心汤药物活性成分作用幽门螺杆菌相关性胃炎靶点的GO富集分析

KEGG通路富集分析共富集101个条目(P<0.05)，筛选排名靠前20的条目进行可视化分析，绘制气泡图，见图5。主要包括TNF信号通路(signaling pathway)、P53信号通路(p53 signaling pathway)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、FoxO信号通路(Foxo signaling pathway)、Nf-kappa B信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、PI3k-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。

图5 加减半夏泻心汤药物活性成分作用幽门螺杆菌相关性胃炎靶点的KEGG通路富集分析

2.6 分子对接结果与分析将“药物-成分-疾病-靶点”网络中的10个化合物与靶蛋白基因进行对接，DockThor在线对接结果具体信息见表4。当结合能小于0时，蛋白和小分子便可以自发地进行结合。分子对接结果表明，经TCMSP数据库筛选得到的10个化合物与靶蛋白结合的结合能都远小于0，可能是治疗幽门螺杆菌相关性胃炎疾病的主要作用成分。选取与关键靶点结合能较好的化合物用Autodock Tools 1.5.6软件进行分析，然后将化合物与关键靶点的相互作用模式用PyMol 2.4软件进行展示，见图6。

表4 10个主要化学成分与靶蛋白的结合能

图6 加减半夏泻心汤主要活性成分与关键靶点的分子对接图

3 讨论

中医药治疗疾病机制复杂，网络药理学能够从整体上系统研究中药成分靶点与疾病靶点之间的作用关系，初步探讨中药复方治疗疾病的内在机制[12]。为了进一步阐明加减半夏泻心汤在幽门螺杆菌相关性胃炎中的药效基础与作用机制，本研究运用网络药理学的方法进行探讨，以期为进一步实验研究和临床应用提供参考。

通过TCMSP数据库进行加减半夏泻心汤成分的筛选及预测靶点，并与幽门螺杆菌相关性胃炎靶点进行映射，发现94个共同靶点共对应255个主要活性成分，其中槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、豆甾醇(stigmasterol)、黄芩素(baicalein)在网络中排名较高，且这3种成分均为黄酮类化合物，可能是加减半夏泻心汤发挥治疗作用的主要成分。黄连、甘草和大枣中均含有槲皮素。研究表明，槲皮素具有广泛的抗炎、抗肿瘤、保护神经系统等作用[21]。黄芩的主要活性成分中汉黄芩素、黄芩素等均为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等多种药理作用[22]。目前，针对黄芩抗炎机制的网络药理学研究表明，其抗炎作用的发挥依赖于减少促炎细胞因子的产生以及减少其与特异性受体结合、抑制启动炎症反应的关键蛋白的表达[23]。同时，汉黄芩素对胃癌细胞的增殖具有抑制作用，可诱导其凋亡并抑制其迁移和侵袭。研究表明，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路激活有关，从而抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖，并诱导其凋亡[24]。黄芩素能够通过干扰花生四烯酸的代谢通路、抑制细胞因子的活性产生抗炎效用[25]。芦荟大黄素具有抗炎作用，对真菌、细菌、病毒有明显的抑制作用[26]。β-谷甾醇通过诱导人胃癌SGC-7901凋亡从而抑制细胞生长[27]，并且通过介导AMPK、PTEN、Hsp90等途径在体内体外抑制人胃癌AGS细胞的生长[28]。研究证明，豆甾醇通过增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的活性发挥抗氧化作用，抑制环氧化酶-2、诱生型一氧化氮合酶的表达发挥抗炎作用[29]。

加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎共有94个共同靶点，进行拓扑分析后共筛选出核心靶点22个，排名靠前的是TNF、JUN、MAPK1、MAPK14、IL-10等。这些靶点主要与炎症、氧化应激、新生血管生成及免疫相关。TNF是具有介导炎症反应、参与免疫及内分泌调节等广泛生物学作用的细胞因子[30]。研究证明，TNF-α表达与幽门螺杆菌感染和疾病严重程度密切相关，TNF-α表达水平在幽门螺杆菌相关性胃炎进展至胃癌过程中逐渐升高[31]。MAPK1、MAPK14属于丝裂原活化蛋白激酶家族，主要参与细胞生长、分化、应激、炎症反应等多种细胞活动。其介导的信号通路在幽门螺杆菌相关性胃炎发生发展过程中发挥着重要作用[32-33]。MAPK1参与多细胞生理活动[34]，同时MAPK14在正常的免疫和炎症反应中非常重要[35]。MAPK14(p38α)的激活是一种氧化和触发黏附蛋白的调节器[36]，主要存在于细胞质中，可通过磷酸化激活MAPKAP2来增强炎性因子的表达和分泌。幽门螺杆菌感染胃上皮细胞后可激活多条MAPK信号转导途径，其中包括ERK1/2、JNK以及p38 MAPK，诱导TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-17等炎性因子分泌[37-38]。因此，MAPK抑制剂可显著抑制幽门螺杆菌感染触发的炎性因子的产生。JUN由c-Fos和c-JUN组成，可介导炎症反应[39]。同时JUN的显性突变体减弱了各种人类肿瘤细胞系的生长行为，它们也干扰了与Ras通路相关的癌基因的转化[40]。IL-10是一种具有抗炎特性的细胞因子，通过限制对病原体的免疫反应，从而防止对宿主的损害，在感染中起着核心作用[41]。

对加减半夏泻心汤治疗幽门螺旋杆菌相关性胃炎共有靶点进行GO功能富集分析发现，其作用机制主要与基因表达的正向调节、炎症反应等生物学过程，酶结合、蛋白质结合、细胞因子活性等分子功能，胞质溶胶、细胞外间质、细胞外液等细胞组成有关。KEGG富集分析之中，主要涉及T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、FoxO信号通路、NF-κB 信号通路、PI3k-Akt信号通路、HIF-1信号通路等。T细胞受体是由6种不同的多肽形成的蛋白质复合物，通过复合物之间的相互平衡，确保了T细胞对各种抗原刺激的有效反应，同时防止自身免疫[42]。Toll样受体在自身免疫性疾病的发病机制中起着重要作用。Toll的异常激活可能导致不受限制的炎症反应。因此，Toll家族可能在自身免疫性疾病的发展中发挥关键作用[43]。Foxo信号通路为多信号通路交汇作用通路，Foxo转录因子广泛存在于真核生物中，上游信号通路，如PI3K/AKT信号通路[44]、MAPK信号通路[45]均能通过激活Foxo转录因子启动下游靶点基因转录，在细胞周期调控以及细胞凋亡中起着重要作用。核因子-κB通路长期以来一直被认为是一种典型的促炎信号通路，当核因子-κB活化后，可激活下游细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等调节免疫或产生炎症反应[46]。PI3K/Akt 信号通路是生物体中重要的信号传导途径，HIF-1 转录因子是一种由HIF-1α和一个稳定的组成性表达的HIF-1β组成的异源二聚体。HIF-1 亚基属于碱性-螺旋-环-螺旋和PER的蛋白家族-ARNT-SIM含结构域的转录因子[47]。HIF-1是一种在机体缺氧条件下转录的活性核蛋白，与炎症、血管舒张、血管生成和造血功能密切相关[48]。

DockThor在线分子对接结果中发现，根据结合能的数值推出，10种主要活性成分(槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、豆甾醇、β-谷固醇、黄芩素、芦荟大黄素、刺芒柄花素、异鼠李素)均能与TNF、JUN、MAPK1、MAPK14蛋白基因结合并形成氢键(以TNF and wogonin、MAPK1 and aloe-emodin、JUN and beta-sitosterol、MAPK14 and baicalein的分子对接可视化为例，说明这10种活性成分有潜在的成药性，能发挥治疗幽门螺杆菌相关性胃炎作用，但也需要进一步的药效学研究。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法对加减半夏泻心汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎作用机制进行了初步探讨，为进一步的实验研究奠定了基础。