载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系的稳定性

张辰辰， 程佳馨， 戴竹青， 何伟伟， 耿宁宁， 李 莹， 李大婧， 宋江峰

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014； 2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；3.宝鸡职业技术学院，陕西宝鸡 721013)

叶黄素是一种重要的含氧类胡萝卜素，可以保护视网膜免受光损伤，对老年性黄斑变性病、白内障、青光眼和糖尿病视网膜病变、色素性视网膜炎等眼疾有预防和缓解作用。此外，叶黄素还具有抗氧化、抑制炎症、抗癌的功效。但是由于叶黄素多烯链结构不稳定，在加工贮藏过程中易受pH值、光照、温度等环境因素的影响而降解损失，同时其水溶性较差，因而利用增溶剂、两亲性聚合物等天然材料对叶黄素进行物理包埋，制备纳米化叶黄素稳定复合体系将有助于扩大叶黄素在食品、药品领域的应用范围。

甜菊苷由亲水性的双侧糖基(葡萄糖基和鼠李糖基)和疏水性的甜菊醇基连接构成，这种双亲性的分子结构与三萜皂苷类较为相似。Zhang等研究发现，甜菊糖苷类物质具有增溶特性，利用甜茶苷制备水溶性的姜黄色素制剂，具有良好的稳定性和生物活性。笔者所在课题组前期利用天然甜菊苷两亲性结构性质制备出甜菊苷-叶黄素复合物，显著提高了叶黄素的水溶性和生物利用率，但体系稳定性较差。研究发现，植物蛋白分子具有良好的生物兼容性、降解性、乳化性及表面活性，能显著提高复合体系的物理稳定性。蛋白质分子因含有大量疏水性、亲水性基团，具有表面活性，能产生乳化作用，常被用于包埋脂溶性功能物质。Wang等研究发现，大豆分离蛋白负载白藜芦醇后，乳状液物理稳定性和氧化稳定性得到了提高。李燕等用乳清分离蛋白-麦芽糖糊精美拉德反应的产物包埋-胡萝卜素，发现此复合物能够显著降低乳状液的粒径，提高-胡萝卜素对光热的稳定性。本研究利用鹰嘴豆分离蛋白和甜菊苷为材料制备载叶黄素的复合体系，研究pH值、盐离子、冻融处理、不同贮藏条件对鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体系和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系稳定性的影响及人工模拟胃肠液中复合体系的稳定性，以期为叶黄素复合体系在功能食品和饮料中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

叶黄素(含量≥90%)，购自上海源叶生物科技有限公司；鹰嘴豆分离蛋白(含量≥85%)，购自陕西帕尼尔生物科技有限公司；甜菊苷(含量≥90%)，购自上海麦克林生化科技有限公司；胃蛋白酶、猪胆盐、胰脂肪酶、糖化酶，均为生化试剂，购自南京奥多福尼生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、二甲基亚砜、乙酸、乙醇、盐酸、氯化钠、氯化钙、氢氧化钠，均为国产分析纯。试验分别于2019年2—5月、2020年4月在江苏省农业科学院农产品加工研究所实验室进行。

1.2 仪器与设备

超声波处理器(UP400S)，德国Hielscher公司；恒温液浴循环两用槽(7HD120)，英国Prima公司；真空旋转蒸发仪(RE-52A)，上海亚荣生化仪器厂；数显测速恒温磁力搅拌器(85-2A)，常州市金坛华伟仪器厂；台式高速离心机(TG16-WS)，湖南湘仪离心机仪器有限公司；电子分析天平(BSA224S)，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；双光束紫外可见分光光度计(UV-6300)，上海美谱达仪器有限公司；水浴恒温振荡器(SHZ-82)，常州国宇仪器制造有限公司；纳米粒度仪(Zetasizer Nano-ZS90)，英国Malvern公司；全自动色差计(CR-400)，日本柯尼卡美能达公司；pH计(PHS-5型)，上海康仪仪器有限公司；电热恒温培养箱(DNP-9052BS-Ⅲ)，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系的制备 参考李青等的方法并加以修改。将鹰嘴豆分离蛋白分散到10 mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH值为7.0)，于室温、500 r/min条件下磁力搅拌2 h。蛋白溶液使用超声波破碎仪进行超声处理，时间为10 min，振幅为37.5 μm，脉冲比为0.5。将超声处理后的蛋白溶液离心(8 000 r/min)10 min，获得的上清液即为蛋白纳米溶液。用10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)配制甜菊苷溶液。将甜菊苷溶液和蛋白纳米溶液混合，磁力搅拌5 min。将溶有叶黄素(20 mg/mL)的乙醇溶液倒入磁力搅拌的甜菊苷-蛋白溶液中，搅拌5 min后进行超声处理，超声条件：脉冲比0.65，振幅72 μm，时间6 min，甜菊苷质量分数为0.5%。超声结束后浓缩去除乙醇，即获得载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系(CPI-STE-LUT)。

1.3.2 pH值对叶黄素复合体系稳定性的影响 测定pH值为3、4、5、6、7、8条件下鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体系和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系的平均粒径、叶黄素乳化产率，用0.1%～1.0%乙酸和氢氧化钠调节体系的pH值。

1.3.3 Na浓度对叶黄素复合体系稳定性的影响 分析添加0、10、20、30、40、60 mmol/L NaCl溶液后鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系的平均粒径、叶黄素乳化产率。

1.3.4 冻融处理对叶黄素复合体系稳定性的影响 将鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体系和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系在-20 ℃冷冻12 h后常温解冻(反复冻融3次)，测定其平均粒径、叶黄素的乳化产率。

1.3.5 不同贮藏条件下叶黄素复合体系的稳定性 分别将50 mL鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体系和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系转移至离心管中，在不同温度(4、25、37 ℃)、避光、非避光条件下进行贮藏试验。分别贮藏0、5、10、15、20、25、30 d后进行取样，测定其平均粒径、叶黄素保留率及色泽的变化。

1.3.6 模拟胃肠液中叶黄素复合体系的稳定性 将鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体系和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系进行胃液、肠液2个阶段的模拟消化，整个过程在恒温振荡水浴系统中进行，温度控制为37 ℃。取10 mL乳液，加入 20 mL 模拟胃液(含2 mg/mL NaCl、3.2 mg/mL胃蛋白酶)，调节pH值至1.2，在恒温振荡水浴锅内消化1.5 h。再调节pH值为7.0，在上述溶液中继续加入7.5 mL模拟肠液(含5 mg/mL胆汁盐、10 mmol/L CaCl、150 mmol/L NaCl、2.4 mg/mL 胰脂肪酶、2.4 mg/mL糖化酶)，于恒温振荡水浴锅中继续消化6 h，分别在1、2、3、4、5、6 h取样，测定叶黄素含量并计算叶黄素的保留率。

1.3.7 理化指标的测定

1.3.7.1 粒度 将鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷-叶黄素复合体系和鹰嘴豆分离蛋白-叶黄素复合体系用10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7)稀释100倍，采用纳米激光粒度仪测量其粒径，仪器设定散射光角度为90°，测定温度为25 ℃，每个样品至少重复测试3次，取平均值。

1.3.7.2 叶黄素含量 取100 μL样液溶于 9.900 mL 二甲基亚砜(DMSO)中，用紫外分光光度计在460 nm处测定其吸光度。标准曲线的绘制方法：精确称取叶黄素标准品(溶于DMSO中)，配制成1～10 mg/L的标准溶液，在460 nm处测量吸光度，以叶黄素含量为横坐标()、吸光度为纵坐标()绘制标准曲线。得到标准曲线方程为=46592 0-0005 6，=0.999 7。根据标准曲线方程确定样液中的叶黄素含量。

1.3.7.3 叶黄素乳化产率 取新鲜制备的叶黄素复合体系，静置1 h后测定叶黄素浓度，按照公式(1)计算叶黄素乳化产率：

(1)

1.3.7.4 叶黄素保留率 叶黄素保留率的计算方法见公式(2)：

(2)

1.3.7.5 溶液色泽的测定 使用CR-400全自动色差计测定溶液色泽，每次使用前分别进行黑板、白板校正，测定时取2 mL液体于样品池中，测头对准样本发光3次后，记录、、值，表示亮度值；表示红绿值；表示蓝黄值，色差值Δ描述待测样品颜色变化，由、、通过计算得到，以空白试验叶黄素乳液为参比标准溶液，注意不要漏光，重复测定3次。色差值(Δ)及饱和度值(Δ)通过公式(3)和(4)计算：

Δ=Δ+Δ+Δ)12；

(3)

Δ=(Δ+Δ)12。

(4)

2 结果与分析

2.1 酸碱稳定性

不同pH值条件下载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系(CPI-STE-LUT)的平均粒径见图1。可以看出，当pH值为4～9时，复合体系的平均粒径随着pH值的升高而大幅减小；当pH值为4～6时，体系的平均粒径大于1 000 nm，出现絮凝、聚结和分层现象，可能因为鹰嘴豆分离蛋白的等电点(PI)在4.5～5.0范围内，此时蛋白质的溶解度减小，所带正负电荷恰好相等，没有相同电荷互相排斥，粒子间相互聚集，进而发生絮凝沉淀，这与崔健等的研究结果相似；当pH值>7时，体系的平均粒径在200 nm左右。在酸性条件下，CPI-STE-LUT三元复合体系的平均粒径大于CPI-LUT二元复合体系，当pH值为8.0时，三元复合体系的粒径最小，仅为196.28 nm，这可能是因为部分甜菊苷分子附着在鹰嘴豆分离蛋白颗粒表面，使蛋白质分子间的静电引力减小，从而减少了颗粒间的相互聚集。

如图2所示，叶黄素的乳化产率随着pH值的提高而升高，在酸性条件下，其乳化产率低于80%，在中性及碱性条件下，其乳化产率均达80%以上。其原因可能是在酸性条件下，鹰嘴豆分离蛋白溶解度下降，导致体系的叶黄素乳化率降低，此外，叶黄素在酸性环境中发生共轭体系碳原子的质子化，加速了叶黄素的降解。对比发现，在中性和碱性条件下CPI-STE-LUT三元复合体系的叶黄素乳化率高于CPI-LUT二元复合体系。

2.2 耐盐稳定性

如图3所示，复合体系的平均粒径随着Na浓度的升高而增大，这与朱振宝等的研究结果相似，即Na离子会引起体系的不稳定。随着离子强度的提高，复合体系中水相离子强度增加，在乳状液中产生静电屏蔽，从而降低粒子间的静电排斥力，诱发粒子絮凝或聚合。并且当盐离子浓度增大时，会引起蛋白质的盐析作用，从而影响其溶解度，降低体系的稳定性。当Na浓度高于60 mmol/L时，三元体系粒径的变大趋势变缓，当Na浓度为100 mmol/L时，二元体系的平均粒径达450 nm，而三元体系的粒径仅为350 nm，可见甜菊苷的引入使得复合体系的耐盐性更好。

由图4可以看出，在复合体系中，随着Na浓度的升高，叶黄素的乳化产率变化不明显，但在不同Na浓度下，CPI-STE-LUT体系的叶黄素乳化产率均高于CPI-LUT。

2.3 冻融稳定性

反复冻融处理后，载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系的平均粒径如图5所示。可以看出，冻融处理后CPI-STE-LUT、CPI-LUT复合体系的粒径明显增大，体系出现絮凝沉淀现象，且甜菊苷的加入并不能抵抗冻融处理对体系的破坏作用。如图6所示，经过冻融处理后，CPI-STE-LUT、CPI-LUT复合体系的叶黄素乳化产率较低，表明复合体系结构已经被破坏，不能有效负载叶黄素。冻融处理对复合体系的破坏力极大，因为体系在冷冻过程中，水快速结冰，造成体系体积变大而形成网状冰晶结构，且冰晶大小、分布都不均匀，不规则的冰晶会插入蛋白质颗粒中，引起界面蛋白质结构的变化，从而破坏了构建的多元复合体系颗粒结构，进而使粒子间的相互作用力失衡，系统稳定性下降；较大的冰晶颗粒会对复合体系颗粒造成挤压，使它们粘连在一起，导致平均粒径异常变大，其次，在解冻过程中，冰晶所构成的网状结构塌陷，冰晶融化、形成空隙，造成复合颗粒结构被进一步破坏。研究发现，在冻融处理过程中，蛋白质会发生变性，如物理、化学及胶束变化，这也会影响体系的稳定性。

2.4 贮藏稳定性

不同贮藏温度及光照条件下载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系的平均粒径变化规律见图7。可以看出，在贮藏过程中体系的平均粒径呈现增大趋势。贮藏温度对体系平均粒径的影响大于光照。在贮藏前5 d，体系粒径增加得最快，而后趋于平缓。在4 ℃避光条件下，体系最为稳定，平均粒径基本没有变化。

如图8所示，随着贮藏时间的延长，叶黄素保留率逐渐降低且在贮藏前的下降速度最快， 其后趋于平缓。在37 ℃光照条件下，叶黄素降解得最快，在贮藏30 d后，叶黄素保留率仅为10%左右，而在4 ℃避光条件下，叶黄素保留率达50%以上。伍敏晖等研究发现，乳清蛋白负载姜黄色素在4 ℃贮藏 25 d 后，色素保留率仅为50%，在37 ℃贮藏30 d后不足5%。除25、37 ℃光照条件外，复合体系在贮藏末期无分层现象，仍保持澄清透明的橙黄色液体状态。

2.5 模拟胃肠液中的稳定性

如图10所示，CPI-STE-LUT和CPI-LUT 2种复合体系在胃液中消化1.5 h时，叶黄素保留率均在90%以上。在模拟胃肠液的消化过程中，随着消化时间的增加，叶黄素的保留率下降，模拟胃肠液消化1 h后，CPI-LUT复合体系中叶黄素的保留率下降得较快，但CPI-STE-LUT复合体系中叶黄素保留率下降得较缓慢；模拟胃肠液消化2～3 h时，CPI-STE-LUT复合体系的叶黄素保留率下降得较快；模拟胃肠液消化3 h后，叶黄素保留率的下降趋势变缓；模拟胃肠液孵育7 h后，2种复合体系叶黄素的保留率在80%左右。可以看出，三元体系能够有效负载叶黄素不被肠道中的消化酶降解，可能由于甜菊苷减少了蛋白质表面基团与胃肠液中的消化酶反应，能够保持复合体系结构的完整，从而减少叶黄素损失。

3 结论

载叶黄素的鹰嘴豆分离蛋白-甜菊苷复合体系是一种较好的营养补充剂，CPI-STE-LUT三元复合体系的耐盐性及耐酸性高于CPI-LUT二元复合体系，且CPI-STE-LUT三元复合体系在中碱性及低盐条件下的稳定性良好。冻融处理会破坏复合纳米颗粒的结构，进而使复合体系失稳。贮藏温度对体系色泽的影响作用大于光照，适宜在4 ℃避光条件下贮藏。CPI-STE-LUT三元复合体系在胃肠液中的稳定性高于CPI-LUT二元复合体系，其能更加有效的负载叶黄素，不被胃肠液中的消化酶降解。CPI-STE-LUT三元复合体系在不同功能食品与饮料中的应用有待进一步展开。