团头鲂基因组微卫星特征及SSR位点开发

张 芹， 王延晖， 王冰柯， 屈长义

(河南省水产科学研究院，河南郑州 450044)

团头鲂()隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲌亚科(Culterinae)鲂属()，为中国特有的淡水经济鱼类。由于团头鲂具有养殖成本低、生长快、成活率高、易捕捞、肉质好等优点，早在20世纪60年代就作为优良的草食性鱼类在全国推广，成为池塘养殖的主要品种之一。微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(simple tandem repeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成。SSR分子标记具有重复性好、多态性高、对模板 DNA 要求低等优点，已广泛应用于鲤鱼、扇贝、中华鳑鲏等水生动物的种质资源鉴定及遗传多样性研究，是水生动物种质鉴定、亲缘关系及种质分类等研究的理想标记。采用传统方法开发SSR分子标记效率低且成本高，与转录组SSR相比，基因组SSR的多态性更高，且在基因组中分布广泛，从而获得更好的图谱覆盖率。利用高通量测序技术开发SSR分子标记能极大提高开发效率，并有效降低成本，已成功应用于多种水生动物的SSR分子标记开发。

该研究旨在利用生物信息学方法分析团头鲂基因组数据，发掘 SSR 位点，了解其特征及分布规律，包括基序结构和类型、比例、重复次数，并设计和合成 SSR 引物，验证其多态性，为团头鲂种质资源的分子指纹图谱构建、品种间遗传多样性分析及分子育种的推进奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年9月从河南省嵩县陆浑水库伊河鲂鱼种厂采集团头鲂伊河群体100尾，从湖北省鄂州国家级团头鲂原种场采集团头鲂华海1号群体100尾，所有个体测量体长、体质量，剪尾鳍用无水乙醇保存，并将样品带回河南省水产科学研究院实验室进行后续试验。

1.2 方法

1.2.1 团头鲂DNA的提取 采用磁珠法基因组DNA提取试剂盒(天根生化)提取团头鲂 DNA，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用超微量分光光度计(NanoDrop One spectroph otometer)检测 DNA 浓度和纯度，置于-20 ℃低温保存。

1.2.2 SSR位点的查找和引物的设计 从NCBI中搜索团头鲂()，得到团头鲂基因组序列信息，将这段基因组序列下载下来后，使用MISA软件进行SSR位点的搜索，搜索的标准：重复基元长度2～6 bp，二核苷酸重复基序的最小重复数为6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基序的最小重复数均为5。2个SSR序列间隔最小值为100 bp。

将得到的SSR位点信息经Primer 5.0软件设计引物，通过严格的筛选，得到9 000余条待选引物。引物筛选的标准：去除重复单元全部由G/C碱基构成的位点(高GC序列不利于批量扩增)；每一条参考序列上只选取1个位点；去除引物长度不是20的位点；选取目的产物在110～350 bp的引物；去掉重复单元重复次数5、6次及以下的位点；不同位点间如果有1条或2条引物序列完全相同的，只保留1个位点。

1.2.3 PCR扩增及SSR检测 从9 000余条待选引物中随机挑选288对SSR引物，其中，每对引物的正向引物(F引物)均加了通用M13接头序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，另外合成加FAM荧光基团的M13荧光接头引物。选择8份团头鲂基因组DNA作为模板对引物进行筛选，选择条带清晰、多态性好的引物进行后续试验。

采用两步PCR法进行扩增。第一步PCR反应体系(10.0 μL)：2×PCR Master Mix 5.0 μL，基因组DNA 1.0 μL，接头上游引物(10p)0.3 μL，下游引物(10p)0.3 μL，ddHO 3.4 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 预变性3 min；95 ℃ 变性 30 s，62 ℃→52 ℃ touch down退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共10个循环；95 ℃ 变性30 s，52 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，共25个循环；72 ℃ 终延伸 20 min。第二步PCR反应体系(10.0 μL)：2×PCR Master Mix 5.0 μL，第一步PCR产物 1.0 μL，荧光引物(10p)0.3 μL，下游引物(10p)0.3 μL，ddHO 3.4 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环；72 ℃末端延伸 5 min。

1.2.4 荧光毛细管电泳检测 PCR产物进行定量稀释后，取1 μL PCR稀释产物加9 μL甲酰胺(含1%内标)变性后上DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测。

1.2.5 结果处理 将毛细管电泳检测结果导入到Gene Marker分析软件中，进行数据整理，每对引物导出PDF峰图文件，结果汇总统计后进行分析。

2 结果与分析

2.1 团头鲂基因组中SSR位点数及分布频率

将已获得的团头鲂基因组数据进行 SSR位点分析，共检测序列 18 243 条，其中含有 SSR位点的序列为 3 940 条，占总检测序列条数的21.60%，检测出 SSR位点共350 898 个，平均约3.1 kb 出现1个SSR位点。含有2 个及2 个以上SSR位点的序列有 2 450 条。其中，二核苷酸重复的位点236 613条，占总SSR位点的67.43%；三核苷酸重复的位点51 527条，占总SSR位点的14.68%；四核苷酸重复的位点52 042条，占总SSR位点的14.83%；五核苷酸重复的位点10 149条，占总SSR位点的2.89%；六核苷酸重复的位点567条，占总SSR位点的0.16%(图1)。

团头鲂基因组中含有丰富的SSR 类型，搜索得到的350 898 个 SSR 位点中，共检测出 1 106 种类型的核苷酸重复，不同核苷酸重复类型出现的比例相差较大，其中，二核苷酸重复类型最少，只有 12 种，占SSR位点重复类型的1.08%；三核苷酸重复类型 60 种，占SSR位点重复类型的5.42%；四核苷酸重复类型217种，占SSR位点重复类型的19.62%；五核苷酸的重复类型最多，达 556 种，占SSR位点重复类型的50.27%；六核苷酸重复类型 261 种，占SSR位点重复类型的23.60%。

此外，从SSR位点的平均分布距离来看，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复在团头鲂基因组中分布距离较小，分别为4.6、21.1、20.9 kb，而五核苷酸、六核苷酸重复位点的平均分布距离分别为107.1 kb和1.9 Mb。二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸类型重复位点的密度远远高于其他2 种类型重复位点的密度。

由图2可知，团头鲂基因组SSR中，二核苷酸重复单元长度为12～144 bp，分布范围主要集中在6～34次，占91%；三核苷酸重复单元长度为12～144 bp，主要集中在5～17次，占99%；四核苷酸重复单元长度在20～200 bp，分布范围主要集中在 5～29次，占99%；五核苷酸重复单元长度为25～225 bp，主要集中分布在5～17次，占97%；六核苷酸重复单元长度30～162 bp，分布范围主要集中在5～15次，占99%。团头鲂基因组中不同重复SSR类型中的重复长度不同，且长度的变异较大。每种重复SSR类型都随着重复长度的递增，微卫星丰度呈递减趋势，即SSR长度越长，微卫星出现频率越低。

2.2 团头鲂基因组中SSR基序类型和频率

从团头鲂基序类型分布看，由表1可知，350 898 个SSR位点中共有257种重复基序，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基序类型分别有4、10、32、95、116种。

表1 团头鲂基因组部分SSR基序类型的分布特征

二核苷酸重复基序类型有4种，即AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG，占总SSR位点类型的67.43%，其中，AT/AT所占比例最高，为29.46%，CG/CG所占比例最低，为0.12%；三核苷酸重复类型基序有10种，其中，AAT/ATT重复类型基序最多，为8.56%；四核苷酸重复类型基序有32种，其中，AGAT/ATCT所占比例最多(4.57%)；五核苷酸重复类型基序以AATAT/ATATT所占比例最多(0.97%)；六核苷酸重复类型以AACCCT/AGGGTT所占比例最高(0.06%)。

2.3 团头鲂基因组多态性SSR引物的筛选

以8份团头鲂DNA为材料，对设计合成的288对SSR荧光引物进行多态性筛选，有149对引物能够稳定扩增出与预期产物一致的条带，引物有效率为51.7%；93对引物表现出多态性。由表2可知，多态性引物占32.3%；其中，18对引物表现出高度多态性，等位基因数大于3，可以稳定扩增且没有杂峰。由图3可知其中1对引物HNF209在4份团头鲂材料中的毛细管电泳检测结果。

表2 筛选的 18 对团头鲂基因组 SSR 位点引物信息

3 讨论与结论

在团头鲂基因组序列共检测出 SSR位点 350 898 个，平均约3.1 kb出现1个SSR位点，低于木荷、甘草等植物，高于卵形鲳鲹、翘嘴鳜等水生生物中SSR位点的出现频率，说明团头鲂基因组 SSR 位点较为丰富。

在大多数物种基因组中，具有短核苷酸重复基元(单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸)的序列较长核苷酸重复基元(四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸)的序列更丰富。在团头鲂SSR序列中，随着核苷酸重复基元的增加，其数量迅速减少，其中，二核苷酸重复的位点 236 613 条，占总SSR位点的67.43%，六核苷酸重复的位点占总SSR位点的0.16%。这个结果与卵形鲳鲹、胡子鲇和长体圆鲹等鱼类的研究结果相似。

团头鲂基因组SSR各重复类别中，从SSR位点的平均分布距离来看，六核苷酸重复(1.9 Mb)>五核苷酸重复(107.1 kb)>三核苷酸重复(21.1 kb)>四核苷酸重复(20.9 kb)>二核苷酸重复(4.6 kb)。

Weber发现完美重复序列PIC值随着重复次数的增加呈现增加的趋势。该研究中，三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复型SSR位点的PIC值与SSR长度均呈正相关，与石榴中的结果一致，说明我们以后在选择SSR标记时应相应选择重复次数较多、序列较长的SSR位点，可能会获得更高的多态性水平。

该研究首次利用生物信息学技术，对团头鲂基因组SSR序列进行搜索和分析，发掘了大量团头鲂 SSR 位点，统计分析团头鲂基因组SSR数量、长度、频率和密度等生物信息学特征，丰富团头鲂分子标记类型，为团头鲂群体遗传结构和遗传多样性分析提供数据基础，有利于加快建立团头鲂种质资源评价与保护机制，也有利于进一步研究团头鲂种质资源多样性和品种选育。

致谢：感谢华中农业大学王卫民教授在团头鲂样品采集过程中给予的帮助。