白头翁汤调控溃疡性结肠炎NKT细胞表达转录因子IL-13的信号通路的作用研究

王学伟,徐丽君,曹 勤,汪 涛,许 健

(上海中医药大学附属普陀医院消化内科,上海 200062)

溃疡性结肠炎(UC)是炎性肠疾病的一种,一般而言,溃疡性结肠炎只局限于结肠,但伴随着结肠疾病的长期发作,UC常累及直肠及其他部位结肠,呈连续性分布,病变环周,表现为黏膜充血,水肿伴渗出,表浅溃疡形成,病理表现为结肠黏膜的慢性非特异性炎症[1-2]。大多数轻、中度UC患者治疗药物主要为5-ASA(水杨酸)类,常用的如美沙拉嗪,口服或直肠给药(栓剂),此类药物主要在肠道局部直接发挥抗炎作用,疗效确切[3-5]。但是,有部分患者病情达远端结肠,即乙结肠、甚至部分降结肠,口服药物到达浓度偏低,难以发挥疗效,而此部位恰是UC的好发部位。因此,进一步提高UC的疗效需要克服以上难题[6],中药治疗成为解决这些问题的新途径。基于中医辨证分型的UC中药临床治疗研究均显示出良好的疗效,且具有良好的安全性,其中以白头翁汤最为著名。白头翁汤出自《伤寒论》,其中记载“热痢下重者,白头翁汤主之”。该方由白头翁、黄柏、黄连、秦皮4味中药组成,具有清热解毒燥湿、凉肝止痢的功效[7-9]。临床研究发现白头翁汤能显著下调UC患者结肠黏膜促炎信号通路蛋白核因子κB(NF-κB)和促炎因子白细胞介素-8(IL-8)的表达[10-11]。白头翁汤还能调控UC患者促炎因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抑炎因子白细胞介素-10(IL-10)的表达失衡[12-13]。通过以上结论,研究建立了C57BL/6小鼠噁唑酮结肠炎模型,分离培养结肠黏膜NKT细胞,首先通过药理学抑制实验明确NKT细胞表达白细胞介素-13(IL-13)的信号通路和转录因子,进而通过白头翁汤及其各组分的含药血清干预试验,明确白头翁汤抑制NKT细胞表达IL-13的相关信号通路和转录因子,最后通过白头翁汤及其各组分的醇提物灌胃治疗C57BL/6小鼠噁唑酮结肠炎,确认其疗效和机制。研究已初步阐明白头翁汤通过调控NKT细胞表达IL-13来治疗UC的可能机制,为进一步研究白头翁汤有效成分及其作用靶点提供了相关依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

人类NKT细胞表达CD161,而小鼠NKT细胞表达NK1.1,故研究选用表达NK1.1的C57BL/6小鼠作为实验动物。选择健康普通级C57BL/6小鼠(6～8周)40只,体重为20±2 g,分为4组:正常组、模型组、白头翁组、美沙拉嗪组,每组10只,由上海斯莱克实验动物有限责任公司供应,生产许可证号码:SCXK(沪),2018-0002,饲养于清洁明亮的动物实验室内,温度23～25 ℃,相对湿度40%～70%,中央空调集中通风8～10次/h,光照12小时明12小时暗,自由进食及饮水。预适应一周。

1.2 主要试剂

噁唑酮、抗生素、二硫苏糖醇(DTT)、Ⅱ型胶原酶、DNA酶I购于美国Sigma公司; 美沙拉嗪肠溶片购于德国莎尔福公司;1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国Gibco公司;anti-NK1.1/FITC和anti-FITC包被的磁珠分离系统MACS购于美国Miltenyi Biotec公司;D-Hank's购于碧云天生物技术有限公司;白头翁汤购于上海中医药大学附属普陀医院。

1.3 主要仪器

倒置显微镜(Olympus公司);CO2恒温培养箱(Sanyo公司);超净工作台(Baker公司);HH·W21·600S电热恒温水箱(上海跃进医疗器械公司);流式细胞仪(BD Biosciences FACSCalibur);移液器(Eppendorf公司);血球计数板(上海跃进医疗器械公司);酶标仪(THERMO);恒温孵育箱(精宏);低温高速离心机(Hettich);电泳仪(BIO RAD)。

1.4 小鼠噁唑酮结肠炎模型的构建

采用体重20 g、雄性、SPF级C57BL/6小鼠,预适应1周。噁唑酮溶于100%的乙醇溶液,制成质量分数为3%的溶液,作为致敏液;噁唑酮溶于50%乙醇溶液,制成质量分数为1%的溶液,作为灌肠液。第1天用0.2%戊巴比妥钠0.2 mL腹腔注射麻醉,在小鼠双肩之间的背部剃毛,暴露2×2 cm的皮肤,取200 μL致敏液涂搽皮肤;第2天再次致敏一次;第5天开始禁食;第6天用戊巴比妥钠麻醉后,将3.5 F软管以无菌石蜡油润滑后,缓慢插入小鼠肛门4 cm处,缓慢注入150 μL噁唑酮灌肠液,拔出导管,保持小鼠头朝下,垂直体位60 s,使噁唑酮溶液留置于肠腔内。

1.5 分离结肠黏膜LPMCs

造模后第3天,断头法处死小鼠,无菌操作、快速取出结肠,仔细剔除干净脂肪组织,用含有10 μg/mL庆大霉素、100 U/mL青霉素、100 μg /mL链霉素的冰PBS充分洗净结肠。沿纵轴剪开结肠,再将结肠剪成不超过5 mm长度的小段。用含有10 mmol/L DTT的不含Ca2+和Mg2+的D-Hank's溶液室温洗30 min,再用含有1 mmol/L EDTA的HBSS-CMF溶液室温洗3次,每次30 min,以去除肠上皮细胞。然后在含有0.02% Ⅱ型胶原酶、0.01% DNA酶Ⅰ、25 mmol/L HEPES的D-Hank's溶液37 ℃孵育1.5 h,消化、分离出单个核细胞。并以200目滤网过滤消化液,收集滤液,1 200 r/min离心5 min,去除上清,再以2 mL D-Hank's液重新浸泡,用巴氏管在其底部缓慢加入2 mL 淋巴细胞分离液,2 800 r/min密度梯度离心30 min,巴氏管小心吸取出界面层细胞1～2 mL,将其1 200 r/min再离心5 min,彻底去除上清。最后以1 mL RPMI 1640(含10%胎牛血清)浸泡细胞,混匀后取一滴置于计数板计数,并用Trypan Blue鉴定细胞活力。

1.6 NKT细胞的分离及鉴定

采用anti-NK1.1/FITC和anti-FITC包被的磁珠分离系统MACS,按操作说明,分离NKT细胞。在含5×105NKT细胞的50 μL提取液中,加入10 μL FITC-anti-NK1.1(绿色荧光),避光孵育30 min,PBS洗涤1次后,用流式细胞仪检测NKT细胞纯度。

1.7 动物分组及给药

将小鼠分为4组:正常组10只、模型组10只、中药治疗组10只、西药治疗组10只。正常组常规喂养,不作任何处理;模型组造模后,常规喂养;中药组给予白头翁全汤灌胃治疗;西药组给予美沙拉嗪灌胃治疗。根据体表面积换算和课题组前期研究的结果,中药醇提物的灌胃剂量为200 mg溶于200 μL PBS中,然后以200 μL/只灌胃。美沙拉嗪的灌胃剂量为200 mg溶于200 μL PBS中,然后以200 μL/只灌胃,模型组和正常组均以等体积蒸馏水灌胃。各组于造模完成的当天,同时开始灌胃治疗,疗程7天。

1.8 检测方法

(1) DAI评分方法 治疗过程中,每天记录小鼠的体重、大便性状及便血程度。大便隐血采用化学法测定。DAI评分标准[8]见表1,计算公式为DAI=(体重下降百分数+大便性状评分+便血评分)/3。

表1 DAI评分标准

(2) 组织病理学观察 取石蜡包埋组织,作常规病理切片,HE染色,进行组织病理学评分,评分标准[14]见表2。

表2 组织病理学评分标准Table 2 Histopathological scoring criteria

(3) 结肠组织蛋白表达检测 取适量结肠黏膜LPMCs,用冰PBS洗涤3次。取适量裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,体积比为1∶100。在冰箱温度为4 ℃条件下裂解20 min。11 000 r/min的低温离心机离心10 min,取上清,测定和调节蛋白浓度。将准备好的样品和蛋白质marker(10-180KD),分别上样电泳。之后将蛋白转至NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入稀释好的一抗抗体,4 ℃过夜。二抗室温1 h 振荡孵育。最后ECL化学发光曝光显色。

1.9 统计分析

采用SPSS 17.0软件,两组间比较采用t检验,多组间比较采用SNK-q检验,p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果分析

2.1 白头翁汤对溃疡性结肠炎小鼠DAI评分的影响

为了建立溃疡性结肠炎模型,研究通过给药恶唑酮诱导小鼠实验性结肠炎。小鼠造模后基础检测指标的变化情况如图1所示。图1(a)显示,注射恶唑酮的小鼠随着作用时间的增加体重逐渐减轻,并且伴随着严重驼背、嗜睡、腹泻等症状。图1(b)显示,与正常组相比,模型组DAI评分显著升高(P<0.01);与模型组相比,白头翁处理组和西药处理组小鼠的DAI评分具有明显差异(P<0.01)。

注:加药组和对照组相比,P<0.01;加药组和模型组相比,P<0.01。图1 小鼠造模后基础检测指标的变化Fig.1 Changes of basic test indicators on mice model

2.2 白头翁汤对溃疡性结肠组织修复的影响

对小鼠溃疡性结肠炎模型及药物治疗组进行病理学观察,结肠炎组织HE染色结果如图2所示。由图2可以看出,溃疡性结肠组织学改变表现为单核细胞跨壁浸润、肠壁增厚、黏膜增生、糜烂、杯状细胞耗损、隐窝结构扭曲,将白头翁汤处理的小鼠和经美沙拉嗪处理的小鼠进行比较,发现白头翁汤比美沙拉嗪处理小鼠的结肠组织在炎症方面有明显改善。未接受治疗的小鼠损伤的严重程度更明显。综上所述,白头翁汤的治疗很大程度上修复了小鼠恶唑酮诱导结肠炎的病理结构的变化。

图2 各组小鼠结肠炎组织HE染色Fig.2 HE staining of colitis tissues of mice in each group

2.3 白头翁汤治疗可显著降低促炎细胞因子IL-13的分泌

采用ELISA分析方法,检测结肠炎小鼠模型在用白头翁汤或美沙拉嗪治疗后结肠组织中IL-13 mRNA的质量浓度的变化,结果如图3(a)所示。采用RT-PCR法测定噁唑酮致结肠炎小鼠结肠组织中白头翁汤或美沙拉嗪治疗前后IL-13mRNA表达水平,结果如图3(b)所示。

注:加药组和对照组相比,P<0.05;加药组和模型组相比,P<0.05。图3 各组小鼠结肠组织IL-13因子质量浓度和mRNA表达水平的变化Fig.3 Changes of IL-13 concentration and mRNA expression levels in colon tissues of mice in each group

由图3可知,正常小鼠结肠组织中IL-13表达水平较低,噁唑酮诱导结肠炎小鼠结肠组织中IL-13表达水平显著上调,用白头翁汤或美沙拉嗪治疗后结肠组织中IL-13表达明显降低。学术研究表明促炎细胞因子的过度产生与组织损伤密切相关,在IBD的发病机制中至关重要[15]。研究对炎症细胞因子在结肠黏膜组织中的表达水平进行了表征。

2.4 白头翁汤调控NKT细胞对IL-13信号通路相关蛋白的表达

对IL-13信号通路相关蛋白进行WB分析,结果如图4所示。由图4可以看出,模型组IL-13的表达量最高,而IL-13信号通路相关蛋白RORγτ、T-bet、GATA3、PLZF模型组表达量最低,经过白头翁汤和美沙拉嗪的治疗,它们的表达水平又有一定程度的升高(P<0.05或P<0.01)。

图4 各组结肠组织IL-13信号通路相关蛋白表达水平的比较Fig.4 Comparison of IL-13 signaling pathway-related proteinexpression levels in each colon tissue group

2.5 白头翁汤治疗可提高结肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达水平

通过免疫印迹法观察溃疡性结肠炎及其治疗组的肠粘膜屏障连接蛋白的表达情况。结肠上皮通透性失调,是由慢性肠道炎症的细胞间紧密连接决定的,这已被认为是IBD的主要缺陷。为了探究白头翁汤治疗是否能保护肠屏障的完整性,研究检测了白头翁汤和美沙拉嗪治疗后小鼠结肠上皮细胞中紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-2的表达水平,结果如图5所示。正如前期实验预想,噁唑酮诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞间紧密连接被破坏,表现为紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平降低,Claudin-2表达水平升高。然而,使用白头翁汤或美沙拉嗪治疗后恢复了Occludin和ZO-1表达水平的改变,几乎达到正常水平。结果表明,白头翁汤能修复由溃疡性结肠炎导致的上皮细胞紧密连接蛋白的表达水平的改变。

图5 Western blot分析结肠上皮细胞连接蛋白表达水平Fig.5 Western blot analysis of colonic epithelialcell connexin expression level

3 讨论

溃疡性结肠炎(UC)的发病原因极其复杂,包括遗传和环境等因素,并且有研究表明UC发病机制与免疫系统的生态失调和结肠组织的损害有关,比如可通过免疫细胞和炎症细胞因子的炎症反应导致[16-17]。研究构建小鼠结肠炎模型后采用ELISA和RT-PCR检测发现,与对照组相比,模型组炎症细胞因子IL-13的表达明显上升(P<0.05),这说明炎症因子的比例变化是引起结肠异常免疫应答的关键因素。临床观察发现,该病的特征呈现慢性和连续性,还有可能累及直肠等部位,最严重的是,该病还有很大可能导致结肠癌的发生,这在世界范围内都是一种常见的消化系统疾病[18]。因此,对UC患者采取正确和及时的治疗至关重要。针对UC病理的特点,目前临床上主要以氨基水杨酸类、糖皮质激素类和免疫抑制剂药物为主,但是这些药物只能暂时缓和症状,长期服用会导致不良反应增多,而且复发率高[19]。有研究表明,白头翁汤具有调节机体中多种细胞免疫因子的作用[18],我们研究发现结肠炎小鼠IL-13因子偏高,故又对模型组小鼠进行白头翁汤灌胃治疗,结果发现白头翁汤和西药组都降低了IL-13的水平(P<0.05),同时我们采用Western blot法检测IL-13相关通路蛋白表达,初步探究了白头翁汤治疗溃疡性结肠炎的可能机制,而且通过HE染色观察发现白头翁汤很大程度上修复了小鼠恶唑酮诱导结肠炎的病理学结构,这可能是修复了结肠上皮细胞之间的连接,因此我们用免疫印迹实验验证白头翁汤是否会对上皮细胞连接蛋白产生影响,结果显示,紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平显著升高,这说明白头翁汤可能通过修复上皮细胞紧密连接蛋白的表达水平来治疗小鼠结肠炎。综上所述,白头翁汤可能是通过降低溃疡性结肠炎NKT细胞表达转录因子IL-13来提高小鼠UC治疗效果,而且研究还初步探究出白头翁汤影响IL-13表达的作用机制。但白头翁汤还可能调节其他的免疫功能,具体机制还有待研究。