快速测定婴幼儿配方乳粉中的维生素B1及B2

梁敏

（福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心，福州 350001）

0 引言

B族维生素是人体必需的营养元素，自身无法合成，须从外界摄入[1-3]。对于食物来源相对单一的婴幼儿而言，婴幼儿配方乳粉中维生素含量偏高或偏低均会对其生长发育带来直接影响。我国对婴幼儿配方食品中的维生素添加量均作出了强制性要求[4-5]。因此，对婴幼儿配方乳粉中维生素含量进行快速准确的测定，对婴幼儿的健康成长具有重要意义。

目前，食品中维生素B1、B2的测定依据是两个独立的标准[6-7]，前处理均需采用高压提取后过夜酶解的方式，成本高，且耗时长，方法重复性差，不利于高通量样品的检测；且市场上获得的酶，大多本底含有维生素B1，需增加空白试验，前处理及后期计算均较为繁琐。故本研究参考标准方法，综合文献报道[8-11]，对前处理条件进行系统优化，通过不断测试，建立高效液相色谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中维生素B1、B2，方法快速准确，重复性高，实用性强，适用于奶粉常规检测，也可为后续标准的修订提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪（配备荧光检测器），美国Waters公司；Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，月旭科技股份有限公司；压力蒸汽灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；Sartorius BSA 224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；高速台式离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；IKA MS 3 basic单发涡旋振荡器，上海沪粤明科学仪器有限公司；维生素B1（盐酸硫胺素，≥99 %），美国Sigma公司；维生素B2（核黄素，≥98%），德国Dr公司；木瓜蛋白酶（酶活≥800 U/g），Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司；高峰淀粉酶（酶活≥3 700 U/g），CNM试剂；正丁醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、盐酸（分析纯，37%）、无水乙酸钠（分析纯）、铁氰化钾（分析纯），上海沪试化工有限公司；氢氧化钾（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；除特殊说明外，其他试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配置

维生素B1标准溶液：准确称取50 mg维生素B1于50 mL容量瓶中，使用浓度为0.01 mol/L的盐酸溶液溶解并定容，得质量浓度1.00 mg/mL标准储备液，置于0～4℃冰箱保存；取标准储备液用水逐级稀释，得质量浓度分别为0.02，0.1，0.5，1.0，2.00 μg/mL的维生素B1系列标准溶液。

维生素B2标准溶液：准确称取10 mg维生素B2于100 mL棕色容量瓶中，使用浓度0.1 mol/L盐酸溶液溶解，沸水浴10 min，取出冷却至室温后定容，得0.10 mg/mL标准储备液，置于0～4℃冰箱保存；取标准储备液用水逐级稀释，得质量浓度分别为0.02，0.1，0.5，2.0，2.00 μg/mL的维生素B2系列标准溶液。

1.2.2 样品处理

称取5.00 g样品于100 mL具塞锥形瓶中，使用约60 mL温水充分溶解样品，加入1 mL盐酸溶液（1+1），摇匀，加塞。将锥形瓶置于高压灭菌锅内，在121℃下保持30 min。水解结束后待冷却，加入氢氧化钾溶液（质量浓度150 g/L）约2 mL（调节溶液pH值约为5～6），样品转移至100 mL容量瓶，定容，摇匀，将样品溶液用滤纸过滤至烧杯，清液备用。

维生素B2测定：取上述清液过0.45 μm滤膜，上机测试。

维生素B1测定：取上述清液400 μL至2.5 mL离心管，加入200 μL碱性铁氰化钾（1.0 g/L），涡旋混匀30 s，准确加入1.00 mL正丁醇，再次涡旋混匀30 s后，于16 000 r/min下离心1 min，取上层过0.22 μm有机滤膜，上机测试。另取400 μL标准溶液进行同步衍生。

1.2.3 液相色谱条件

流动相为浓度0.05 mol/L乙酸钠：甲醇=65∶35；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为35℃；维生素B1为激发波长375 nm，发射波长435 nm；维生素B2为激发波长462 nm，发射波长522 nm。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 酶解步骤的去除

国家标准中规定，食品中维生素B1、B2的测定均需要经过高压水解，而后进行酶解（约16 h），耗时长，且经过多次转移，目标化合物可能会出现不必要的损失或降解。乳粉中的维生素基本来自人为添加，部分以游离态形式存在，只有小部分被糖或蛋白质等化合包裹，同时，由于维生素B2的溶解性较差，因此考虑保留高压水解过程。经过试验表明，高压水解后样品中的大分子物质即可被破坏，从而释放出维生素B1和B2。故本研究尝试省略酶解步骤，并将B1和B2前处理进行合并，结果满意，极大的降低了耗材成本和时间成本。

2.1.2 蛋白质的沉淀

张隆龙[10]等人做了相似研究，乳粉经过高压后直接进行维生素B2的检测及维生素B1的衍生化。试验发现，只经过高压水解后的样品处于乳浊状态，无法得到澄清溶液，对后期样品的过滤造成困难，且测定结果重复性较差。故本研究采用调节溶液pH值的方式使蛋白质沉淀。奶粉中主要含乳清蛋白和酪蛋白[12]，等电点在4.6～4.8之间，但由于乳粉基质各不相同，添加的金属离子可使等电点出现不同程度的偏移，故碱的添加量也稍有不同。实验结果表明，当氢氧化钾溶液（质量浓度150 g/L）添加量为2 mL时，溶液pH值约为5～6，样品基本能得到较好的沉淀效果。

2.1.3 维生素B1衍生条件的优化

在保证取样具有代表性的情况下，本研究将待衍生试样体积减少至400 μL，同比降低后期有毒有机试剂正丁醇的使用量，同时，由于衍生试样的减少，可使样液与衍生试剂在短时间内充分混匀，加快反应效率；选择使用2.0 mL离心管进行衍生反应，加入正丁醇提取后可直接进行高速离心，有效降低了由多次转移带来的回收率损失。在该条件下对衍生剂的浓度进行优化，确定衍生剂质量浓度为1.0 g/L时，样品衍生效果最佳。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性范围、检出限及定量限

将维生素B2系列标准工作液、维生素B1标准衍生液注入色谱仪，以对应得到响应值来绘制标准工作曲线，分别以3倍和10倍信噪比来进行计算检出限及定量限。结果见表1，目标化合物在对应浓度范围内的线性关系良好，检出限及定量限均低于国家标准，满足检测要求。图1为标准溶液色谱图，维生素B1和B2分别在6 min和5 min之内出峰，单个样品检测时长控制在11 min，有利于样品快速分析，同时可减少由维生素B1衍生物降解带来的误差[13]。

图1 维生素B1和B2标准溶液色谱

表1 维生素B1和B2的回归方程、相关系数、线性范围、检测限及定量限

2.2.2 精密度及回收率

随机抽取一份乳粉样品进行精密度试验，采用本方法对样品进行处理后进样分析（n=6），连续测定3 d，得维生素B1、B2日内精密度分别为1.98%、1.23%，日间精密度分别为3.12%、2.87%，表明该方法精密度良好。

取6份不同品牌（A，B，C，D，E，F）的婴幼儿配方乳粉，各添加适量标准溶液，得3个浓度水平加标试样，按照本方法进行分析，每个添加水平平行测定3次。实验结果如表2所示，维生素B1回收率在92.4%～100%之间，维生素B2回收率在93.0%～102%之间，符合检测要求。

表2 6种婴幼儿配方乳粉中维生素B1和B2加标回收率（n=3） mg/100g

2.3 实际样品测定

随机抽取20批次不同品牌及段位的奶粉，采用本方法及标准方法进行测定，每个样品平行测定3次，取均值进行比较，含量统计见表3。结果显示，部分乳粉中维生素B1、B2测定值高于标准方法，其原因可能为标准方法中酶解时间过长，目标化合物发生降解，同时表明该方法测定值更接近真实值；20批次乳粉测定值与标准方法测定值之间的相对误差小于5.77%，表明该方法适用于婴幼儿配方乳粉中维生素B1及B2的检测。

表3 不同方法测定20批次乳粉中维生素B1和B2测定结果比较（n=3） mg/100g

(续表3)

3 结论

目前，食品中维生素测定相关国家标准的建立大多是针对单一化合物，而婴幼儿配方乳粉中一般会同时添加多种营养元素，采用标准方法进行测定，成本高，效率低。为提高检测效率，多物质的联测是该行业发展的重要方向之一。对于多维生素联测的研究目前多使用液相色谱质谱串联[14-20]，仪器昂贵，对操作人员要求高，不利于作大规模推广；且维生素结构多样，对前处理的要求不同，复杂样品基质的多维生素联测，很大程度上只是单纯缩短了检测时间，难以保证样品中目标化合物的提取效率，实用性不强；而直接采用高效液相色谱进行测定的多联测研究，样品也多集中在保健品、功能性饮料、营养强化剂[21-26]等相对简单的基质。本研究基于目标化合物的理化性质以及样品基质特性，建立高效液相色谱联合荧光检测器测定幼儿配方乳粉中维生素B1、B2的方法。通过大量数据表明，该方法快速，准确，可应用于婴幼儿配方乳粉中维生素B1、B2的常规检测，具有较强的现实意义和推广价值。